Kortsiktiga fritt flytande segment kulturer från den vuxna mänskliga hjärnan

Vi presenterar ett protokoll för att förbereda fritt flytande skiva kulturer från hjärnvävnad som samlats in från levande mänskliga givare lämnas till resective hjärnkirurgi. Denna kultur är mottagliga för att utföra biokemiska och cellbiologi analyser eller immunohistokemi. Det förväntas bidra till klarläggandet av mekanismen bakom neurodegeneration i associerade hjärnsjukdomar.

Den största fördelen med denna teknik är att det är ett enklare och kostnadseffektivt alternativ till den klassiska skiva kultur protokoll med hjälp av membran skär. Även om det övergripande protokollet inte är komplex, vissa steg såsom avlägsnande av hjärnhinnor, limning av vävnaden till vibratome exemplar skivan och samband för immunohistokemi är bäst förstås när det visas visuellt. Hjälper till att visa förfarandet kommer att Niele Mendes och Glaucia Almedia som är grad studenter, och Giovanna Nogueira, en annan grad student.

För att börja detta förfarande, tillsätt salt till en hink med is. Överför skivningslösningen till denna hink och låt den vila under karbiogenblandningen som bubblar i minst 20 minuter före användning. Därefter förbereder du ett block på 3%-agarose som är ungefär två centimeter med två centimeter med två centimeter.

Superlim agarosblocket till vibratome-preparatskivan för att skapa ytterligare mekaniskt stöd till vävnadsprovet vid skivning. På vibratomen, ställ in sektionens tjocklek på 200 mikrometer, vibrationsfrekvensen till 100 hertz, och välj en skivningshastighet mellan 0,5 och 1,0 millimeter per sekund. Lås sedan vibratombuffertstråget på vibratombasen och tillsätt is för att hålla den i kylskåp innan den tas emot skivningslösningen och provet och under hela skivningsproceduren.

Först inrätta en transportapparat som består av en bärbar gascylinder som innehåller en karbiogenblandning som är ansluten till en tryckflussventil som styr gasens utgång som är ansluten till silikonrör som förbinder denna gasproduktion med transportfartyget och transportfartyget som innehåller transportlösningen och is för provkylning under transport. Samla och transportera exemplaret och transporten enligt textprotokollet. Överför preparatet till en petriskål som innehåller skivningslösning.

Med hjälp av fina kirurgiska verktyg, ta försiktigt bort så mycket av de återstående hjärnhinnorna som möjligt. Välj den bästa provexemplamentet orientering för att producera skivor med de särskilda egenskaperna hos den experimentella designen och använda ett nummer 24 skalpell blad för att trimma en plan yta för att vara basen som kommer att limmas på preparatskivan. Med hjälp av en destruktion plast sked och känsliga penslar, samla fragmentet från Petri-skålen och torka av överflödig lösning med filterpapper.

Därefter använder superlim för att fästa vävnaden till vibratome exemplar skålen tills den är fast vidhäftad till skålen och i kontakt med agaros blocket. Placera vibratome-preparatskivan i vibratomens buffertfack. Lås knivhållaren på plats med rakbladet ordentligt fast.

Tillsätt skivningslösning och se till att den täcker både preparatet och bladet. Sedan börja skära exemplaret i 200 mikrometer skivor. Överför skivorna från buffertfacket till en petriskål som innehåller skivningslösning och trimma eventuella lösa kanter och överflödig vit materia till en andel av cirka 70%cortex och 30%vit substans.

I ett laminar flödesskåp, tillsätt 600 mikroliter av odlingsmedium till varje brunn av en 24-brunnsplatta och inkubera vid 36 grader Celsius med 5%koldioxid i minst 20 minuter före plätering av skivorna. Efter detta, använd en pensel för att platta en skiva i varje brunn. Om det finns några oanvända brunnar i plattan, fyll dem med 400 mikroliter sterilt vatten.

Inkubera vid 36 grader Celsius med 5%koldioxid. Tillägg 10 milliliter av det tidigare beredda odlingsmediet med hjärnan härledd neurotrofa faktor vid en koncentration av 50 nanogram per milliliter. Efter åtta till 16 timmar, ta bort 333 mikroliter av det betingade mediet från varje brunn och tillsätt 133 mikroliter av färskt BDNF kompletterat medium.

Ersätt en tredjedel av det konditionerade mediet med färskt BDNF kompletterat medium var 24:e timme. För först överför skivorna från brunnarna som innehåller odlingsmedium till en ny 24-brunnsplatta som innehåller PBS. Ta bort PBS från varje brunn och ersätta den med en milliliter av 4%paraformaldehyd.

Inkubera över natten vid fyra grader Celsius. Nästa dag, försiktigt ta bort paraformaldehyd från brunnarna och ersätta den med en milliliter av 30%sackaros lösning. Inkubera vid fyra grader Celsius i 48 timmar.

Efter 48 timmar, ställ in frysning mikrotom till negativa 40 grader Celsius. Förbered en sackarosbas på mikrotomstadiet där skivorna ska placeras. Efter det är fryst helt, skär några av de frysta sackaros för att producera en plan yta på vilken skiva kommer att placeras.

Placera sedan varje skiva över en sträckt plastfilm och använd en pensel för att platta till vävnaden. I ett enda drag överför du den utsträckta skivan till den frysta sackarosbasen. När skivan har vilat i fem till 10 minuter för att frysa ordentligt, skär skivan i 30 mikrometersektioner.

Överför 30 mikrometersektionerna till en petriskål som innehåller PBS och gå vidare till ett histologiprotokoll som är adekvat för den experimentella designen. Vid fastställandet av kvalitet och hälsa odlade skivor, en kritisk aspekt att utvärdera är närvaro och typiska morfologi av de förväntade neurala celltyper, nervceller och gliaceller celler. Den typiska arkitekturen av den mänskliga när laminering observeras i en skiva på dag in vitro fyra avslöjas av neuronal immunolabeling.

Dessutom observeras också den förväntade förekomsten av mikroglia och astroglia. Dessa resultat visar att vävnadsarkitektur inte påverkas nämns i någon större utsträckning vare sig av det kirurgiska ingreppet, provbehandlingen eller av kortvariga perioden in vitro. Neuronal svar på kaliumklorid-inducerad depolarisering har också kvantifierats i odlade skivor genom att följa ERK fosforylering.

Intressant nog ses en tydlig ökning av ERK-fosforylering i kaliumkloridbehandlade skivor på dag in vitro-fyra. Slutligen utvärderas svaret av skivor på dag in vitro-fyra till en toxisk utmaning med en känd oxidativ stress inducerare väteperoxid. Utsätta skivorna till 300 millimol väteperoxid i 24 timmar ledde till en kraftig minskning av MTT minskning.

Sammantaget, den massiva celldöd observerats i dag in vitro fem skivor efter väteperoxid utmaning och kaliumklorid-inducerad depolarisering resultat visar bevarade allmänna hälsa skivor på dag in vitro fyra som svarar på en giftig stimulans såsom oxidativ stress. Detta protokoll är främst ägnas åt studier baserade på analyser som varar än en vecka såsom undersökning av molekylära mekanismer för neurotoxicitet och neuroprotektion av kandidat läkemedel. Även om detta protokoll ägnas åt att använda när vävnad som samlats in från patienter som lämnats till kirurgisk behandling för mikroresistenta temporala LOB epilepsi, det är troligt att vävnad som samlats in från andra hjärnan regioner eller villkor kan också källor för att producera fritt flytande skiva kulturer.

Slice kulturer från vuxna mänskliga hjärnan kan vara nyckeln till att främja vår förståelse av mänskliga neuropathologies på grund av deras unika cellulära kretsar och molekylära maskiner saknas i skivor som produceras från gnagare hjärnor.