Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Extremt snabb och specifik metabolisk märkning av RNA in vivo med 4-Thiouracil (Ers4tU)
Summary August 22nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Användningen av thiolated uracil att känsligt och specifikt rena nyligen transkriberade RNA från jästen Saccharomyces cerevisiae.
Transcript
Denna metod är betydande eftersom inget annat protokoll tillåter nyligen syntetiserade RNA att analyseras på så kort tid skala, och tillåta puls-chase experiment med en sådan kort puls. Detta protokoll fungerar bra med protein utarmning, såsom Best AID 4U-protokollet. Den största fördelen är att bakgrunden är låg.
Detta gör att de korta märkningstider, genom att ta bort nästan alla nonthiolated RNA. Det skriftliga protokollet beskriver också många olika typer av experiment som skulle kunna utföras och hur man integrerar dem i denna teknik. Till att börja detta förfarande, växa jäst i YMM medium till en OD 600 mellan 0,6 och 0,8.
I en draghuv, tillsätt en metanol motsvarande 30 till 50%av den avsedda provvolymen till ett 50 milliliterrör. Stäng rören tätt, märka dem, och placera dem på torris för att kyla. Därefter etikett två milliliter rör för långsiktig lagring av proverna och placera på is för att svalna.
Lägg zirkonikulärpärlorna till de två milliliterrören. Kyl minst en milliliter vatten per prov på is. Om en S.pombe spik ska läggas till kulturen, placera en alikvot av tiolerad S.pombe celler på is att tina.
Vortexa den tinade alikvoten och lägg till den i kulturen. Tillsätt sedan 4tU till kulturen till en koncentration av 10 mikromolar och blanda kraftigt. Thio-label under en längre tid mellan 15 sekunder och fem minuter.
Ta prov på kulturen med jämna mellanrum till slutet av tidskursen. Tillsätt varje prov till ett av de beredda centrifugrören som innehåller metanol. Försegla varje rör, skaka för att blanda ordentligt, och placera på torris.
När alla prover har tagits, placera dem alla på is. Se till att inget av proverna har frusit. Om någon har frusit, värm dem försiktigt i handen medan invertering ständigt.
Centrifugera cellerna vid 3, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i två minuter för att pelleta cellerna. Häll av vätskan och resuspend pelleten i minst en milliliter iskallt vatten genom att kraftigt pipettera upp och ner. Överför fjädringen till det förberedda skruvlocksröret och lägg röret på is.
Centrifugera proverna kort vid en hastighet som är större än 13, 000 gånger g för att åter pelleta cellerna. Placera sedan tillbaka dem på is, och ta bort vätskan. Först, lägg i 400 mikroliter av AE-buffert, 40 mikroliter av SDS, och 800 mikroliter av fenol vid ett lågt pH.
Resuspend genom att vortexa i 10 sekunder. Sedan lyse cellerna i en homogenisator för tre två minuters skurar på den lägsta effektinställningen. Låt proverna på is i två minuter mellan homogeniseringspulserna.
Placera de lyserade cellerna på torris i fem minuter tills den stelnar. Därefter använder en mikrocentrifug för att snurra cellerna med en hastighet över 13, 000 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur. Efter detta, utföra fenol kloroform extraktion och kloroform extraktion som beskrivs i texten protokollet.
Tillsätt mellan 1/3 till 1/2 av volymen av 10 molar litiumklorid och blanda för att fälla ut RNA. Centrifugera med en hastighet över 13, 000 gånger g i fem minuter. Ta bort vätskan, och kort snurra provet för att ta bort drägg.
Sedan, tvätta pelleten med 300 till 500 mikroliter av 70%etanol. Centrifugera den tvättade pelleten kort, och avlägsna eventuell kvarvarande etanol. Återlösa RNA-pelleten i 90 mikroliter te vid ett pH 7.0 genom att värma vid 65 grader Celsius medan du skakar.
Efter kontroll av fullständig RNA solubilisering, överför suspensionen till ett 0,2 milliliter rör. Till att börja med biotinylera genom att tillsätta 10 mikroliter HPDP-biotinlösning till RNA och blanda noggrant. Inkubera i mörker vid 65 grader Celsius i 15 till 30 minuter.
Därefter förbereda en liten harts volym, storlek uteslutning kolumn för att utesluta den oinkorporerade biotin. Ta bort bottentaggen på kolonnen, lossa locket och placera kolonnen i ett centrifugrör på två milliliter. Centrifugera vid 1, 500 gånger g i en minut för att spola ut bufferten och kassera genomflödet.
Lägg sedan försiktigt till 0,3 milliliter TE till kolumnens överkant och snurra igen med samma villkor. Överför den tvättade kolonnen till ett färskt 1,5 milliliterrör. När provinkubationen är klar, lägger du till provet till kolumnens överkant.
Centrifugera vid 1, 500 gånger g i två minuter, vilket lämnar det biotinylerade RNA-provet i botten av röret. Kasta kolumnen. Och tillsätt 1/3 till 1/2 volym av 10 molar litiumklorid till röret som innehåller provet.
Blanda för att åter fälla ut RNA. Först åter upplös RNA i 200 mikroliter av DEPC-behandlat vatten. Mät RNA-koncentrationen, och beräkna volymer för varje prov som kommer att ge lika stora mängder RNA för alla prover.
Lägg till denna mängd RNA till ett nytt rör, och tillsätt DEPC-behandlat vatten tillbaka upp till en total volym av 200 mikroliter. När ett prov är i rumstemperatur, tillsätt 25 mikroliter av 10 x NaTM buffert, 25 mikroliter av en molar natriumfosfat, och 2,5 mikroliter av 10%SDS. Blanda noggrant, och centrifug försiktigt vid cirka 100 gånger g i mindre än 30 sekunder.
Förbered två milliliter av pärlbuffert för varje prov med en x NaTM-buffert, 0,1 molar natriumfosfat och 0,1%SDS. Tillsätt 50 mikroliter streptavidin pärlor till en låg retention 1,5 milliliter rör. Placera röret på magnetstället och vänta på att pärlorna ska lägga sig.
Ta sedan bort vätskan genom aspiration. För att tvätta pärlorna, tillsätt 200 milliliter av pärla buffert och virvel tills pärla pelleten är helt resuspended. Centrifugera röret vid ungefär 100 gånger g i högst fem sekunder.
Placera röret i magnetstället för att låta pärlorna fångas upp av magneten. Avlägsna vätskan genom aspiration om det finns ett litet antal prover. Häll av vätskan och aspirera sedan om det finns många prover.
Block med 200 mikroliter av pärlbuffert, 10 mikroliter glykogen, och 2,5 mikroliter av tRNA. Inkubera i rumstemperatur i 20 minuter medan roterande över slutet vid måttlig hastighet. Efter detta, ta bort vätskan och tvätta igen, som beskrivs i textprotokollet.
Resuspend pärlorna i provet, och inkubera i rumstemperatur i 30 minuter medan roterande. Under denna inkubation, preparera ett färskt 1,5 milliliterrör för varje prov. Tillsätt 1/10 volym av tre molarnatriumacetat vid pH 5,3 och 20 mikrogram glykogen.
Centrifugera vid ungefär 100 gånger g i tre sekunder. Ta bort det obundna RNA:na från pärlorna och tvätta dem så som det skisseras i textprotokollet. För att elera RNA, tillsätt 50 mikroliter av nyberedda 0,7 molar beta merkaptoetanol till pärlorna.
Efter vortexing och centrifugering, placera slurry i den magnetiska rack. Pipettera RNA-innehållande lösningen i de beredda centrifugrören på 1,5 milliliter. Elute en gång till som tidigare beskrivits.
Placera sedan tillbaka provet i det magnetiska stället för att avlägsna kvarvarande pärlor från det eluterade RNA och överföra vätskan till ett färskt, lågt bindande centrifugeringsrör med 0,5 milliliter. Blanda provet. Och tillsätt sedan 2,5 volymer etanol till fällning nsRNA.
Efter blandning och inkubering, centrifug med en hastighet av minst 13, 000 gånger g och vid fyra grader Celsius i 20 minuter. Typiska avkastningar för snRNA som återvinns genom att använda detta protokoll, visas här. Observera att RNA-återhämtning vid tidpunkt noll är en mycket liten del av den som återhämtat sig från längre tidspunkter med endast 0,3 mikrogram RNA som återvinns från cirka 30 miljarder celler.
Efter bara 30 sekunder av märkning, men över dubbelt så mycket RNA samlas in från samma antal celler. I bioanalyzerspåret kan våra RNA-prekursorer ses som en topp nära 1, 000 nukleotider och en doublet av toppar på 1, 700 till 1, 800 nukleotider. Överflödet av dessa intermediärer ökar som tiolering fortsätter.
Tiolering utförs sedan med prover som tas med 15 sekunders intervall från starten av tio-märkning och bearbetningen av ACT1 RNA-avskrift övervakas. Som kan ses pre-mRNA och lariats genereras även efter bara 15 sekunder av märkning. Efter ca 45 sekunder till en minut når mängden lariats och pre-mRNA jämvikt med så mycket av dessa RNA-arter som skapas genom transkription som bearbetas bort genom splitsning.
De svåraste stegen är de som involverar pärlor, tvätt och blockering. Var försiktig så att du inte tappar pärlorna, eller att låta dem torka ut. När du har renat nyligen syntetiserade RNA, kan du använda någon traditionell RNA-analys förfarande.
Det rekommenderas att du kör RNA på en bioanalyzer eller liknande. Därefter använder vi normalt QPCR och RNA-Seq för att analysera RNA. Denna metod visade sig vara idealisk för att analysera kinetiken i RNA-bearbetning.
De mest farliga stegen är de som använder fenol och kloroform i RNA-extraktionen. Varje gång du använder dessa kemikalier i en oförseglig behållare, gör det i en rök huva, och bära lämpliga skyddskläder, en labbrock, och handskar. Var särskilt försiktig att det inte finns några zirkonia pärlor i gängan på skruvlocket röret, eftersom det kommer att leda till en läcka.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
