Developmental Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Dissektion, kultur och analys av primära kraniella neurala krön celler från musen för studiet av neurala Crest cell delaminering och migration
Chapters
Summary October 3rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Detta protokoll beskriver dissektion och kultur av kranial neurala krön celler från musmodeller, främst för studier av cell migration. Vi beskriver de levande avbildningstekniker som används och analysen av hastighet och cell formförändringar.
Transcript
Detta väldefinierade protokoll tittar på primär neural crest migration hos däggdjur. Vi använder primära neurala crest migration för att studera fosterskador som påverkar den neurala krönet. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för oss att ta en närmare titt på neurala crest celler som de dyker upp ur neurala plattan.
Testning för cellbeteenden i vävnader som bär på mutanta gener lockelser eller efter farmaceutisk behandling, tillåter hälsoscreening för effekterna av läkemedelsbehandling eller miljöförändringar under embryonal utveckling. Ett liknande tillvägagångssätt kan användas för att studera neurala crest celler som migrerar till hjärtat eller tarmen eller att studera metastaserande tumörceller. Gissa anatomi embryot rätt är utmanande.
Dess vävnader förändras mycket snabbt under tidig utveckling. Vi föreslår att öva mikrodission innan du utför ett stort experiment. Eftersom embryona är levande och tredimensionella är snabbhet och precision avgörande.
Vid embryonal dag 8.5, använd sterila verktyg och lösningar för att skörda livmodern till en behållare med iskall PBS. Skär mesometrium för att separera varje embryo. Dissekera livmodern noggrant, separera varje decidual svullnad.
Att skörda embryot i rätt utvecklingsstadium är avgörande för den reducerande variationen och ökar framgången i explantans vidhäftning till matrisen såväl som cellmigration. Skjut tyckor mellan muskellagret och embryots decidual vävnad och använd ett andra par tärna för att ta bort muskellagret. Använd tlympor för att genomborra decidua vid kanterna av mesometrial dra och använda det andra paret av tövråkningar för att riva vävnaden öppna vinkelrätt mot dra.
Skala tillbaka den decidual vävnaden med tången för att visualisera ricarts membranet innan försiktigt ta bort membranet. Den viscerala äggula sak kommer att bli synlig och embryot kommer att observeras inuti. Ta bort den viscerala äggulan sak och anjonen, och placera embryot för att tillåta visualisering av huvudvecket.
Skär huvudet luckan ovanför hjärtat och skrapa bort den underliggande mesoderm för att få en ren neural platta. Neurala plattan gränser bör sedan dissekeras. Med hjälp av ett glas Pasteur pipetten, överföra dissekerade neurala plattan på en hydrogel belagda skålen fylld med konditionerade neurala krön medium och försiktigt snurra skålen för att placera neurala plattan i mitten av brunnen.
Sedan inkubera neurala plattan vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid för lämplig experimentell tidsperiod. Vid 24 timmar efter explanting, placera vävnadskultur skålen i provet innehavaren av ett ansiktskontrast mikroskop, och tejpa ner tallriklocket och koldioxid nål för att förhindra skakningar under flera brunnar förvärv. Fokusera sedan på kraniala neurala crest celler vid en 10 gånger förstoring med en matchande fas ring i kondensorn valt.
För att kvantifiera neurala crest cellen flyttande, ställ in mikroskopet att förvärva en ram var femte minut vid en 10 gånger förstoring. För att kvantifiera cell morfologi, ställ in mikroskopet att förvärva en bildruta per minut vid en 40 gånger förstoring. För att kvantifiera lamellipodia dynamik, ställ in mikroskopet att förvärva en ram var 10 sekunder i 10 minuter vid en 40 gånger förstoring.
För multi-well imaging, ställ in den mekaniska scenen för att flytta mellan utvalda X, Y positioner av intresse, och bekräfta att kraniala neurala crest celler är i fokus och att scenen positioner är korrekta. Klicka sedan på förvärva för att starta time lapse imaging. För enstaka cellspårning öppnar du bild J och importerar data som tiff stack-filer.
Ändra orientering och ljusstyrka och kontrastnivåer och klicka analysera och ställ skala för att kalibrera punktstkfilerna i pixelmikrometrar enligt mikroskopinställningar. Klicka på plugin-program, spårning och manuell spårning för att öppna bilden J manuell cell spårning plugin och välj lägg spår för att börja cellspårning. Spåra sedan celler genom alla ramar av timelapse-filmer med hjälp av kärnan som referenspunkt.
För att bedöma neurala crest migatorkapacitet, öppna en lämplig migreringsanalys programvara program och klicka på fliken importera data för att importera cellen spårningsdata som en punkt txt fil. Under datamängder och initiering väljer du antalet segment eller bildrutor som ska analyseras och ange X Y-kalibrering och tidsintervall mellan bildrutorna. Välj använd inställningar för att spara inställningarna.
Välj sedan plotdatasymbolen för att bilda bantomter och välj statistiksymbolen för att kvantifiera avstånds- och hastighetsmåtten. För att kvantifiera neurala crest cell område och circularity, öppna bild J och under analysera och ställa in mätningar, klicka för att markera cellen form parametrar, cellområdet, omkrets och form deskriptor. Använd verktyget för fri handmarkering för att manuellt rita en kontur runt varje cell med hjälp av cellmembrangränserna som en guide.
Tryck på Kontroll+B-tangenter på tangentbordet för att behålla cellkonturöverlagringen på bilden och upprepa för varje cell över varje tidsram. Klicka på bildöverlägg och för att nå av intressehanteraren och markera de celler av intresse. Klicka sedan på mått för att erhålla värdena för de valda cellformsparametrarna av intresse.
Inom 24 timmar efter explant och kultur, en region i pre flyttande epitelial hjärnskålen neurala krönet kan tydligt observeras att omger den neurala plattan explant. Vidare kommer en subpopulation av neurala crest celler har genomgått epitelial till mesenkymala övergången och visas helt mesenkymala. Explant kulturer pläterade på antingen en extracellulär matris-baserade hydrogel eller fibronectin, bildar liknande explant strukturer som består av neurala platta premigratory neurala krön och flyttande neurala crest cell populationer.
Men explants pläterade på fibronectin producera celler med mer framträdande lamellipodia på cellen framkant till synes mer polariserad i riktning mot migration. Time lapse mikroskopi möjliggör spårning av X, Y koordinater av enskilda celler och analys av neurala crest cell migration och analys av kranial neurala crest cell morfologi dynamik över tiden. Genom att beskriva enskilda cellmembran, cellområde och perimeter mätningar kan beräknas från alla ramar av filmerna för att möjliggöra den efterföljande kvantifiering av cellområdet och cirkuläritet av enskilda och grupper av celler.
Observera att när cellerna migrerar bort från explanten ökar cellområdet avsevärt medan cellernas cirkuläritet förblir relativt konstant, vilket tyder på att när celler avgår från epitelkanten och förlorar cell till cellkontakter, visar de ökat cellspridningsområde. Var särskilt uppmärksam på att skrapa bort den underliggande mesoderm för att få en ren neural platta, eftersom detta främjar migration av neurala crest celler bort från vävnaden. Många andra tekniker som immunfärgning, RTPCR, eller encellig analys kan utföras för att analysera olika proteiner eller gener av intresse bland olika populationer av odlingsceller.
Vi är intresserade av utvecklingsrullarna av några viktiga neuroblastomgener som kan vara involverade i neural crest cell migration och att använda denna metod för att studera mänskliga sjukdomar gener.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
