Developmental Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Dissectie, cultuur en analyse van primaire Cranial neurale Crest cellen van de muis voor de studie van neurale Crest Celdelaminatie en migratie
Chapters
Summary October 3rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.
Transcript
Dit goed gedefinieerde protocol kijkt naar primaire neurale kammigratie bij zoogdieren. We gebruiken primaire neurale kammigratie om geboorteafwijkingen te bestuderen die de neurale kam beïnvloeden. Deze aanpak stelt ons in staat om de neurale kuifcellen nader te bekijken als ze uit de neurale plaat tevoorschijn komen.
Testen op celgedrag in weefsels die gemuteerde genen allures of na farmaceutische behandeling, maakt gezondheidsonderzoek voor de effecten van medicamenteuze behandeling of veranderingen in het milieu tijdens de embryonale ontwikkeling. Een soortgelijke aanpak kan worden gebruikt om neurale kamcellen te bestuderen die migreren naar het hart of de darm of om uitgezaaide tumorcellen te bestuderen. Het raden van de anatomie van het embryorecht is een uitdaging.
De weefsels veranderen zeer snel tijdens de vroege ontwikkeling. We raden aan om microdissection te beoefenen voordat we een groot experiment uitvoeren. Omdat de embryo's in leven zijn en driedimensionaal, zijn snelheid en precisie cruciaal.
Gebruik op embryonale dag 8.5 steriele gereedschappen en oplossingen om de baarmoeder te oogsten in een container met ijskoude PBS. Snijd de mesometrium om elk embryo te scheiden. Ontleed de baarmoeder zorgvuldig, het scheiden van elke deciduele zwelling.
Het oogsten van het embryo in de juiste ontwikkelingsfase is van cruciaal belang voor de verminderende variabiliteit en het vergroten van het succes in de hechting van de explant aan de matrix en celmigratie. Schuif tangen tussen de spierlaag en het deciduele weefsel van het embryo en gebruik een tweede paar tangen om de spierlaag te verwijderen. Gebruik de tangen om de decidua aan de randen van de mesometrial pull te doorboren en gebruik het tweede paar tangen om het weefsel loodrecht open te scheuren naar de trekkracht.
Schil het deciduele weefsel terug met de tangen om het ricartsmembraan te visualiseren voordat het membraan zorgvuldig wordt verwijderd. De viscerale dooier sak zal zichtbaar worden en het embryo zal binnen worden waargenomen. Verwijder de viscerale dooier sak en de anion, en de positie van het embryo om visualisatie van de hoofdplooi mogelijk te maken.
Snijd de hoofdvouwen boven het hart en schraap het onderliggende mesoderm weg om een schone neurale plaat te verkrijgen. Neurale plaat grenzen moeten dan worden ontleed. Met behulp van een glazen Pasteur pipet, breng de ontleed neurale plaat op een hydrogel gecoate schotel gevuld met geconditioneerde neurale kam medium en zachtjes wervelen de schotel om de neurale plaat positie in het midden van de put.
Vervolgens broeden de neurale plaat op 37 graden Celsius en 5% kooldioxide voor de juiste experimentele periode. Plaats na 24 uur uitplanten de weefselkweekschotel in de monsterhouder van een gezichtscontrastmicroscoop en plak het plaatdeksel en de kooldioxidenaald af om te voorkomen dat schudden tijdens multi-well acquisitie. Focus dan op de craniale neurale kuifcellen bij een 10 keer vergroting met een bijpassende fasering in de geselecteerde condensor.
Om de neurale kamceltrekcapaciteit te kwantificeren, stel de microscoop in om elke vijf minuten één frame te verwerven bij een vergroting van tien keer. Om celmorfologie te kwantificeren, stel de microscoop in om één frame per minuut te verwerven bij een 40 keer vergroting. Om de lamellipodiadynamiek te kwantificeren, stelt u de microscoop in om elke 10 seconden gedurende 10 minuten één frame te verwerven bij een 40-vergroting.
Voor multi-well imaging, stel de mechanische fase te verplaatsen tussen geselecteerde X, Y posities van belang, en bevestigen dat de craniale neurale kuif cellen zijn in focus en dat de fase posities correct zijn. Klik vervolgens op acquire om de time lapse imaging te starten. Open afbeelding J voor het bijhouden van één cel en importeer de gegevens als tiff-stackbestanden.
Wijzig de oriëntatie- en helderheids- en contrastniveaus en klik op analyseren en schaal instellen om de dot stk-bestanden in pixelmicrometers te kalibreren volgens de microscoopinstellingen. Klik op plug-ins, tracking en handmatig bijhouden om de plug-in voor het bijhouden van de afbeelding J te openen en selecteer track toevoegen om te beginnen met het bijhouden van cellen. Volg vervolgens cellen door alle frames van time-lapse films met behulp van de kern als referentiepunt.
Als u de migratiecapaciteit van de neurale kam wilt beoordelen, opent u een geschikt softwareprogramma voor migratieanalyse en klikt u op het tabblad gegevens voor importgegevens om de celtrackinggegevens als een dot txt-bestand te importeren. Selecteer onder gegevenssets en initialisatie het aantal segmenten of frames dat moet worden geanalyseerd en stel de X Y-kalibratie en tijdsinterval tussen frames in. Selecteer instellingen toepassen om de instellingen op te slaan.
Selecteer vervolgens het plotgegevenssymbool om trajectplospunten te vormen en selecteer het statistieksymbool om de afstands- en snelheidsmetingen te kwantificeren. Als u het neurale kamcelgebied en de circulariteit wilt kwantificeren, opent u afbeelding J en opent u onder metingen en stelt u metingen in om de parameters van de celvorm, het celgebied, de omtrek en de vormbeschrijving te selecteren. Gebruik het gereedschap Vrije handselectie om handmatig een omtrek rond elke cel te tekenen met behulp van de grenzen van het celmembraan als leidraad.
Druk op Control+B-toetsen op het toetsenbord om de overlay van de celcontour op de afbeelding te behouden en herhaal deze voor elke cel gedurende elk timelapseframe. Klik op afbeeldingsoverlay en om interessemanager te bereiken en selecteer de interessecellen. Klik vervolgens op meten om de waarden te verkrijgen voor de geselecteerde celvormparameters van belang.
Binnen 24 uur na explant en cultuur, een gebied van de premigrerende epitheelale hersenschius kan duidelijk worden waargenomen om de neurale plaat explant. Bovendien zal een subpopulatie van neurale kuifcellen epitheliale naar mesenchymale overgang hebben ondergaan en volledig mesenchymal lijken. Explant culturen verguld op een extracellulaire matrix-gebaseerde hydrogel of fibronectin, vormen soortgelijke explant structuren bestaat uit neurale plaat premigratory neurale kam en migrerende neurale kuif cel populaties.
Nochtans produceren de explants die op fibronectin worden verguld cellen met prominentere lamellipodia bij de cel leading edge schijnbaar meer gepolariseerd in de richting van migratie. Time lapse microscopie maakt het bijhouden van X, Y coördinaten van individuele cellen en de analyse van neurale kuifcelmigratie en de analyse van craniale neurale kuifcelmorfologiedynamiek in de tijd mogelijk. Door het schetsen van individuele celmembranen, celgebied en perimeter metingen kunnen worden berekend uit alle frames van de films om de daaropvolgende kwantificering van het celgebied en circulariteit van individuele en groepen cellen mogelijk te maken.
Merk op dat als de cellen migreren uit de buurt van de explant, de cel gebied aanzienlijk toeneemt, terwijl de cellen circulariteit blijft relatief constant, wat suggereert dat als cellen afwijken van de epitheliale rand en verliest cel aan celcontacten, ze tonen verhoogde cel verspreiding gebied. Besteed bijzondere aandacht aan het wegschrapen van de onderliggende mesoderm om een schone neurale plaat te verkrijgen, omdat dit de migratie van neurale kuifcellen uit de buurt van het weefsel bevordert. Veel andere technieken zoals immunostaining, RTPCR, of eencellige analyse kan worden uitgevoerd om verschillende eiwitten of genen van belang onder verschillende populaties van cultuurcellen te analyseren.
We zijn geïnteresseerd in de ontwikkelingsrollen van enkele belangrijke neuroblastoomgenen die betrokken kunnen zijn bij neurale kamcelmigratie en in het gebruik van deze aanpak om menselijke ziektegenen te bestuderen.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
