Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En ektopisk Chemokine uttrycks modell för att testa macrophage rekrytering in vivo
Chapters
Summary September 25th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
För att testa effekten av en Chemokine på makrofag rekrytering in vivo, var hela Mount in situ hybridisering används för att upptäcka ektopisk uttryck för Chemokine, och immunofärgning användes för att märka makrofager. Live Imaging användes för realtids observation av makrofagmigrering.
Transcript
Protokollet som beskrivs här tillåter oss att undersöka funktionen av en chemokine och beteendet hos makrofag in vivo. De flesta av befintliga experimentella modeller av cellgiftsbehandling är baserade på in vitro-cellexperiment. Men in vitro-experiment ibland är för enkla att modellera den komplexa miljön in vivo.
Dessutom kan de inte representera den kemoattraktion förmåga i vivo. Dessa metoder utnyttjar den specifika fördelen med zebrafisk för direkt cellbeteende observation, vilket är svårt för möss. Börja med att generera TGFABP-10A interleukin-34 transgena konstruktioner.
Injicera FABP-10A interleukin-34 konstruktioner i en cellsteg Tg(mpeg1:GFP)transgena och en fiskembryon av vildtyp tillsammans med transposasen MRNA. Höj och samla in embryona enligt manuskriptinstruktioner. Sedan, fixa dem med 4%paraformaldehyd över natten vid 4 grader Celsius eller i två timmar vid rumstemperatur.
Efter fixering, tvätta embryona med PBST tre gånger i fem minuter per tvätt. Torka embryona separat med 50%metanol i PBST, följt av 100%metanol, sedan byta till färska 100%metanol, och lagra dem på negativa 20 grader Celsius i minst 2 timmar. När du är klar för sondhybritisering, rehydrera embryona separat i 50%metanol i PBST.
Tvätta dem sedan med PBST tre gånger i fem minuter per tvätt. Smält embryona med proteinas K i PBST vid rumstemperatur. Sedan, kasta digestionslösningen, och upprepa fixering med 4%paraformaldehyd i 20 minuter vid rumstemperatur.
Efter fixering, tvätta embryona två gånger med PBST i 10 minuter per tvätt. Utför prehybridisering med uppvärmd hybridiseringsbuffert vid 65 grader Celsius i minst en timme. Värm sedan interleukin-34 sonden till 65 grader Celsius i 10 minuter.
Återvinn hybridiseringsbufferten i det ursprungliga röret och utför hybridisering med den förvärmda sonden vid 65 grader Celsius över natten. Nästa dag tvätta embryona med 50%formamid och 2X SSCT följt av 2X SSCT och sedan 0,2X SSCT vid 65 grader Celsius. Upprepa varje tvätt tre gånger med 20 minuter per tvätt.
Sedan tvätta embryon tre gånger med PBST i fem minuter per tvätt. Blockera proverna med 600 milliliter blockeringsbuffert under en timme i rumstemperatur. Tillsätt sedan 400 mikroliter av anti-digoxigenin HRP-antikroppslösning och inkubera embryona i fyra grader Celsius över natten.
Nästa dag tar du bort antikroppen och tvättar embryona sex gånger med PBST i 20 minuter per tvätt. Efter den sista tvätten, skölj varje prov med 30 mikroliter av 1X plus förstärkning spädningsmedel i fem minuter. Inkubera proverna i fluorofore tyramin arbetslösningen i fem till 15 minuter i mörkret.
Förlängning av inkubationstiden till 30 minuter om signalerna är svaga. Sedan tvätta embryon med PBST tre gånger i 10 minuter per tvätt. Och inkubera dem med den primära antikroppen vid fyra grader Celsius över natten.
Nästa dag tvätta embryona fem gånger med PBST i 30 minuter per tvätt, och inkubera dem med de sekundära antikropparna vid fyra grader Celsius över natten. På nästa dag, tvätta embryon tre gånger i PBST i 10 minuter per tvätt, och förvara dem i 70%glycerol i mörker vid fyra grader Celsius eller negativa 20 grader Celsius längre. Före avbildning, använd ett fluorescensmikroskop för att välja DS-röda och GFP-dubbla positiva embryon.
För att montera fisken, använd ett metallbad för att värma en milliliter på 1%låg smältning uppstod till över 90 grader Celsius. Sedan, kyl den till kroppstemperatur och blanda i 50 mikroliter av 0,2%trikain. Överför de sövda embryona till en liten skål monterad med en täckrutschbana på undersidan.
Ta bort det omgivande vattnet och släpp långsamt den låga smältande agaros på embryona. Ställ försiktigt in fiskens läge innan agarosen har stelnat, hålla leverområdet nära täckglaset. När agarose har stelnat, noga täcka den med ett annat lager av agaros att förstärka den.
Placera skålen på konfokalmikroskop bärare bord, täck fisken med E2-lösning med trikain, och starta bildbehandling. För att använda konfokalmikroskopet, öppna Programvaran Zen Black 2.3 och klicka på locate, sedan inkubation, och ställ sedan in temperaturen till 29 grader Celsius. Klicka på förvärvsmenyn och välj det nödvändiga skanningsläget och lasrar i menyn för smart inställning.
Välj sedan Z-stack och position. Klicka på den experimentella designermenyn och välj aktivera multi block experiment i det första blocket för att hitta provet under låg förstoring. Därefter växlar du till den höga förstoringen och låter det observerade området i mitten av synfältet.
Ställ in informationen om position och Z-stack. Välj sedan lämplig laserintensitet, skanningslager och bildhastighet. När alla block är setup, ställa in lämpligt antal slingor och börja inspelningen.
Detta protokoll användes för att injicera en lever-specifika interleukin-34 över uttryck plasmid i transgena fisk embryon, som makrofager var märkta med GFP. Full montera fluorescens i situ hybridisering och immunfärgning användes för att analysera uttrycket av interleukin-34 och de GFP märkta makrofager. Macrophage cell nummer var kvantitativt analyseras i uninjected och konstruera injicerade embryon'lever och svans regionen.
Live imaging användes för att direkt observera makrofager, märkt grön, passerar levern av en kontroll fisk och migrerar in i levern av en interleukin-34 över uttrycka fisk. De viktiga stegen i detta protokoll inkluderar valet av en lämplig transgen linje för att märka den cell av intresse. Och lämplig vävnad för imaging ditt uttryck av transgena gen samt en lämplig observationstidsfönster.
Denna teknik skulle kunna tillämpas för att studera funktionen av andra kemokiner på beteendet hos andra celler, såsom T-celler och neutrofiler in vivo.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
