Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering av region-spesifikke Mikroglia fra en voksen mus Brain halvkule for Deep single-celle RNA sekvensering
Chapters
Summary December 3rd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi tilbyr en protokoll for isolering av mikroglia fra ulike dissekert regioner av en voksen mus hjerne halvkule, etterfulgt av semi-automatisert bibliotek forberedelse for dyp enkelt celle RNA sekvensering av full lengde transcriptomes. Denne metoden vil bidra til å belyse funksjonell heterogenitet av mikroglia i helse og sykdom.
Transcript
Denne metoden tillater objektiv fangst av mikroglia genuttrykk på encellet nivå, noe som kan bidra til å belyse mikroglias molekylære heterogenitet i en sunn og syk hjerne. Den største fordelen med denne teknikken er at den gir en detaljert prosedyre for rask isolering av mikroglia fra forskjellige hjerneregioner og viser hvordan man effektivt kan generere spillebase encellede RA6-biblioteker for dyp sekvensering. For å starte denne prosedyren, klargjør alle nødvendige buffere og løsninger som beskrevet i tekstprotokollen og chill dem på is.
Etter euthanizing og halshugge musen, bruk liten saks for å kutte åpne huden på hodet for å avsløre skallen under. Deretter skjærer du gjennom sagittal sutur, lambdoidal sutur og koronar sutur. Bruk tang til å trekke av begge sider av parietal bein og interparietal bein uten å skade vevet og forsiktig flytte hjernen inn i en disseksjon Petri parabolen som inneholder medium A.Bruk en pre-kjølt blad, skjære hjernen gjennom midtlinjen i to halvkuler.
Bruk nummer 55 tang for å skille lillehjernen fra kortikale flik og hjernestammen. Deretter bruker du nummer 55 tang for å forsiktig dissekere ut hippocampus og striatum fra cortex og overføre hvert vev til en egen samling Petriskål. Bruk først et barberblad til å hogge hver hjerneregion i fine biter som er mindre enn en kubikkmillimeter.
Ved hjelp av en en milliliter pipette med spissen avskåret, overfør vevsbitene til forkjølte Dounce homogenisatorer. Homogenisere vevet ved sakte å vri stempelet inn og ut av Dounce homogenisator for seks til 10 fulle slag til ingen synlige biter er til stede. Deretter overfører du det dissosierte vevet til 50 milliliter rør gjennom 70 mikrometersiler.
Skyll hver Dounce homogenisator og stempel med totalt seks milliliter kaldt medium A og overfør deretter skyllingen til et 15 milliliter rør for sentrifugering. Sentrifuge encellede suspensjon på 400 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter med en pause på fem. Skyll en stor uttømmingskolonne og tre store markeringskolonner i en magnetisk separator med tre milliliter MCS.
Når sentrifugeringen for vevsprøvene er fullført, pipette ut og kast supernatant uten å forstyrre pelleten. Resuspend cellene i MCS buffer som inneholder RNase hemmer. Tilsett 100 mikroliter myelin fjerning perler til hvert rør som inneholder re-suspenderte celler fra cortex og cerebellum og tilsett 50 mikroliter myelin fjerning perler til hver av rørene som inneholder re-suspendert celler fra hippocampus og striatum.
Inkuber rørene på is i 10 minutter. Etter dette, legge MCS til røret som inneholder kortikale celler for å bringe volumet opp til to milliliter og til de resterende rørene for å bringe hver av sine volumer opp til en milliliter. Når kolonnene er tomme for skyllebuffer, laster du to milliliter kortikale celler på den store uttømmingskolonnen og en milliliter av hverandre cellesuspensjon på separate store utvalgskolonner.
Deretter vasker du de store uttømmingskolonnene med én milliliter MCS-buffer og vasker hver store markeringskolonne to ganger ved hjelp av én milliliter MCS-buffer for hver vask. Filtrer cellene gjennom 35 mikrolitersilsilhett i rundbunnede FACS-rør. Sentrifuge disse rørene på 400 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter for å pellet cellene.
Deretter, sakte helle ut overnaturlig og dab kanten av røret på silkepapir. Gjenoppusst cellene i hvert rør med 300 mikroliter FACS-buffer. Først legger du til fem mikroliter mus FC reseptorer blokkere reagens til hvert rør.
Inkuber på is i fem minutter. Deretter legger du til en mikroliter CD45 PE størrelse syv og en mikroliter CD11B BV421 til hvert rør. Inkuber rørene på en shaker ved romtemperatur i 10 minutter.
Etter dette legger du til to milliliter FACS-buffer for å vaske. Sentrifuge på 400 ganger g og ved fire grader Celsius i fem minutter for å pellet cellene. Resuspend cellene i hvert rør med 400 mikroliter FACS buffer som inneholder en mikroliter RNase hemmer og 0,5 mikroliter propidiumjodid.
Etter standard FACS-prosedyren sorterer du enkelt levende mikroglia med en 100 mikrometerdyse i 96-brønns PCR-plater som inneholder fire mikroliter lysisbuffer i hver brønn. Virvle platene kort og spinn dem ned ved hjelp av en benkeplate sentrifuge. Oppbevar platene på minus 80 grader Celsius til bibliotekforberedelsen.
Når du er klar til å fortsette, tin platen på is. Bruk en termisk cycler til å utføre en første transkripsjon for å generere cDNA og forsterke cDNA med et ekstra exonuclease fordøyelsestrinn som beskrevet i tekstprotokollen. Etter dette renser du cDNA ved å legge til 18 mikroliter magnetiske perler til hver brønn.
Inkuber platen på et magnetisk stativ i fem minutter. Fjern deretter supernatanten og vask prøvene to ganger med nylaget 80% etanol ved hjelp av 80 mikroliter etanol per brønn for hver vask. For å utføre tagmentasjon, bruk en nanoliter pipetteringsmaskin til å blande 0,4 mikroliter av hver cDNA-prøve med 1,2 mikroliter Tn5 tagmentasjonsreagenser fra bibliotekets forberedelsessett i en 384-brønnsplate ved 55 grader Celsius i 10 minutter.
For å stoppe merkereaksjonen, legg til 0,4 mikroliter nøytraliseringsbuffer ved romtemperatur i fem minutter. Deretter, på 384 indekser og 1,2 mikroliter pcr blandet til eksemplene og forsterke bibliotekene som beskrevet i tekstprotokollen. Samle alle de enkelte bibliotekene fra samme 384-brønnsplate sammen og bruk magnetiske perler for å rense de endelige samlede bibliotekene.
I denne studien er microglia isolert fra cortex, cerebellum, hippocampus og striatum av en voksen mus hjernehalvdel. Den forberedte cellesuspensjonen undersøkes under et mikroskop ved hjelp av trypanblå og et hemocytometer for å estimere utbyttet, celle levedyktigheten og effekten av myelinfjerning før du utfører antistofffarging. Totale celletall på dette punktet bør være over 30.000 for cortex og over 5.000 for de andre vevene.
Over 90% av cellene skal være levedyktige med lite myelinavfall. En FACS-maskin brukes til å sortere microglia, som vanligvis er CD45 lav og CD11B positiv. Vellykket isolasjon bør generere over 80% microglia ut av alle levende enkeltceller, i hvert fall for kortikale vev.
Når individuell mikroglia er fanget inn i lysisbufferen, frigjøres RNA og deretter reversere transkribert til cDNA, som deretter forsterkes i 23 sykluser. Som en kapillær elektroforeseplattform gir fragmentanalysatoren og høysensitive NGS-fragmentsett rask og nøyaktig informasjon om størrelsesfordeling, samt mengde cDNA-molekyler som finnes i hver brønn av en 96-brønnsplate. Prøver som viser et smør mellom 500 og 5000 basispar og er over en viss konsentrasjonsterskel kan brukes til å lage biblioteker.
Prøvene er sekvensert til en dybde på over en million rå leser per celle, som metter deteksjonskraften til encellede RNA sekvenseringsmetodikk. Med en kartleggingshastighet på ca. 60 % over 2, kan 000 gener påvises per mikroglial celle. Tidligere publiserte data generert fra denne isolasjonsmetoden reproduseres fra uavhengige eksperimenter, noe som viser følsomheten for å oppdage mikrogliaspesifikke gener på tvers av den sekvenserte befolkningen.
Med informasjon om enkle microglia transkripsjoner, forskere kan oppdage de unike cellepopulasjoner i sammenheng med deres interesse, og videre studere den funksjonelle relevansen av disse nyidentifiserte populasjoner.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
