ऑप्टोजेनेटिकल मॉडुलेटेड कार्डियोमायोसाइट गतिविधि का विद्युत मूल्यांकन

कार्डियोमायोसाइट गतिविधि पर विभिन्न ऑप्टोजेनेटिक एक्ट्यूएटर के बायोफिजिकल प्रभाव के रूप में प्रोटोकॉल का उपयोग हृदय ऊतक और पूरे दिलों में ऑप्टोजेटिक प्रयोगों के विकास में सहायता करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है। सारकोमर ट्रैकिंग और कार्बन फाइबर असिस्टेड फोर्स मापन के साथ पैच क्लैंप तकनीक के संयोजन से, हम वेंट्रिकुलर कार्डियोमायोसाइट्स के इलेक्ट्रिक और यांत्रिकी पर GtACR1 फोटोएक्टिवेशन के प्रभावों का अध्ययन कर सकते हैं। ऑप्टोजेनेटिक अवरोध संभावित रूप से ऑप्टिकल डिफिब्रिलेशन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

GtACR1 एक ऑप्टोजेनेटिक उपकरण है जो हृदय गतिविधि को बंद करने में सक्षम बनाता है। यह तकनीक चिकनी और एकल कोशिका मांसपेशी कोशिका अध्ययन जैसे अन्य शोध क्षेत्रों पर पूरी तरह से लागू होती है। हालांकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए नहीं किया जा सकता है, यह कार्डियोमायोसाइट इलेक्ट्रिकल और मैकेनिकल फ़ंक्शन के व्यापक विश्लेषण के लिए एक साधन प्रदान करता है।

तो जैसा कि कहा जाता है, एक तस्वीर एक हजार से अधिक शब्द कहते हैं । हम वीडियो में कितनी अधिक जानकारी प्राप्त कर सकते हैं? हमारे उपकरणों और तकनीकों में से कुछ एकल मायोसाइट खींच और जांच की तैयारी में शामिल अत्यधिक जटिल है और यह बहुत आसान है उन्हें एक विवरण की तुलना में एक वीडियो में व्यक्त करने के लिए।

नौ से 10 सप्ताह पुराने न्यूजीलैंड सफेद खरगोश से खारा perfused दिल से बाहर धोया गया है के बाद, एक कम कैल्शियम, उच्च पोटेशियम समाधान के लिए perfusate स्विच और दो और मिनट के लिए दिल को छिद्रित करने के बाद दिल की धड़कन बंद हो जाता है । एंजाइम समाधान को बढ़ाएं, पाचन के दो मिनट बाद एंजाइम समाधान को जलाशय में वापस फिर से प्राप्त करना शुरू करें, और पाचन के पांच मिनट बाद गति को 16 मिलीलीटर प्रति मिनट तक कम करें। एक बार जब ऊतक पाचन के 40-50 मिनट के बाद नरम दिखाई देता है, तो कैनुला से दिल को काट लें और तुरंत समाधान को अवरुद्ध करने में दिल को रखें।

जब तक ऊतक पूरी तरह से कवर न हो जाए तब तक अवरुद्ध समाधान जोड़ें। दाएं वेंट्रिकल और पट को काट लें और बाएं वेंट्रिकल को अलग करें। पेपिलरी मांसपेशियों को हटा दें और यांत्रिक वियोजन द्वारा कोशिकाओं को छोड़ने के लिए धीरे-धीरे ऊतक को खींचने के लिए ठीक संदंश और एक पिपेट का उपयोग करें।

एक मिलीमीटर चुकता छिद्रों के साथ एक जाल के माध्यम से सेल निलंबन फ़िल्टर करें और अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं को तलछट करें। फिर ताजा ब्लॉकिंग समाधान में कार्डियोमायोसाइट पेलेट को फिर से रीसस्ट करें। एक पैच क्लैंप प्रयोग के लिए, कोट ऑटोक्लेवेड सेल संस्कृति से पहले तुरंत लेमिनिन के मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर 100 माइक्रोग्राम के साथ पेट्री डिश में कवरस्लिप।

कार्बन फाइबर प्रयोग के लिए, 95-से-पांच इथेनॉल-टू-वॉटर समाधान में पॉली-हेमा के 0.12 ग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ कोट पेट्री व्यंजन। कार्डियोमायोसाइट्स को रीसस्ट करने के दस से 15 मिनट बाद सुपरनॉट को हटा दें और कल्चर मीडियम में कोशिकाओं को रीसस्ट करें। गिनती के बाद, 1.75 गुना 10 के लक्ष्य घनत्व पर एक पेट्री डिश में एक कवरस्लिप पर कोशिकाओं को बीज प्रति मिलीलीटर चार कोशिकाओं के लिए।

संस्कृतियों को तीन से चार घंटे तक ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेट करें । इनक्यूबेशन के अंत में, 75 के संक्रमण की बहुलता पर GtACR1-eGFP के लिए एडेनोवायरस टाइप फाइव कोडिंग युक्त ताजा माध्यम के साथ कवरस्लिप संस्कृतियों से माध्यम को प्रतिस्थापित करें। 48 घंटे के लिए इनक्यूबेटर के लिए संस्कृतियों को वापस करें।

पैच क्लैंप प्रयोग करने के लिए, सोडा लाइम ग्लास केशिकाओं से 1.7 से 2.5 मेगाओम पैच पिपेट खींचने और डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर को शुरू करने के लिए माइक्रोपिपेट पुलर का उपयोग करें। बाहरी समाधान वाले मापने वाले कक्ष में कोशिकाओं के साथ एक कवरलिप रखें और इसके ईजीएफपी फ्लोरेसेंस के आधार पर कार्डियोमायोसाइट का चयन करें। इसके बाद, आंतरिक समाधान के साथ एक पैच पिपेट भरें और पिपेट धारक को आंतरिक समाधान में सिल्वर क्लोराइड लेपित सिल्वर रिकॉर्डिंग वायर डालने के लिए संलग्न करें।

शून्य मिलीवोल्ट की आधार रेखा के साथ 15 मिलीसेकंड के लिए 10 मिलीवोल्ट दालों को लागू करने के लिए झिल्ली परीक्षण निर्धारित करें। सेल-संलग्न विन्यास तक पहुंचने के बाद, डेटा अधिग्रहण सॉफ्टवेयर में शून्य से 60 मिलीवोल्ट की होल्डिंग क्षमता के साथ पूरे सेल मोड पर स्विच करें। फिर धीरे-धीरे झिल्ली को तोड़कर पूरे सेल कॉन्फ़िगरेशन तक पहुंचने के लिए नकारात्मक दबाव लागू करें।

एक सफल टूटना मापा क्षमता में तत्काल वृद्धि से सबूत होगा । शून्य पिकोपेरे पर वर्तमान क्लैंप मोड में 300 मिलीसेकंड या एक्शन क्षमता की हल्की दालों के साथ शून्य से 74 मिलीवोल्ट्स पर वोल्टेज क्लैंप मोड में रिकॉर्ड फोटोएक्टिवेशन प्रोटोकॉल। कार्बन फाइबर का उत्पादन करने के लिए, पहले पुलर के पिपेट धारकों पर पिपेट माउंट करें।

लगभग 11 मिलीमीटर की कुल पतला लंबाई और लगभग 30 माइक्रोमीटर के अंतिम आंतरिक व्यास के साथ दो पिपेट में ग्लास केशिकाओं को खींचें। इसके बाद, ओरिएंटेशन सर्कल में एक केशिका को संरेखित करने के लिए स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और एक शराबी के साथ केशिका की नोक पर नीचे धकेलकर इसे 45 डिग्री तक मोड़ें। जब तक केशिका शराबी को हटाने के बाद भी 45 डिग्री कोण बनाए रखती है तब तक फिलामेंट को गर्म करें।

केशिका को झुकने के बाद, ट्यूब से एक कार्बन फाइबर लेने के लिए नरम ट्यूबिंग से लैस ठीक संदंश का उपयोग करें और इसे केशिका के ठीक टिप में फिट करें। केशिका में फाइबर को मोड़ तक पुश करें। कार्बन फाइबर काटें ताकि वे केशिका की नोक से दो मिलीलीटर प्रोजेक्ट करें और प्रत्येक केशिका के सामने के खंड में फाइबर को ठीक करने के लिए साइनोएक्रिलेट गोंद का उपयोग करें।

फाइबर को जांचने के लिए, माइक्रोमैनीपुलेटर और एक पीजो मोटर द्वारा नियंत्रित धारक को एक केशिका संलग्न करें। सेंसर की ओर केशिका ले जाएं और इसे सेंसर के सापेक्ष संरेखित करें। किसी भी बल का उत्पादन किए बिना बल सेंसर के संपर्क में फाइबर की नोक रखें।

पीजो मोटर का कुल मूवमेंट 60 माइक्रोमीटर है। फोर्स सेंसर की ओर छह 10 माइक्रोमीटर स्टेप्स में पीजो मोटर को मूव करें । सेंसर में प्रति वोल्ट 0.05 मिलीनॉटन की संवेदनशीलता और शून्य से 0.5 मिलिनेवकों की बल सीमा है।

प्रत्येक चरण के लिए मापा वोल्टेज बाहर पढ़ें और सेंसर से कार्बन फाइबर को दूर। कार्डियोमायोसाइट्स करार के बल को रिकॉर्ड करने के लिए, पॉली-हेमा के साथ एक कवरग्लास की सतह को कोट करें और इसे मापने वाले कक्ष में रखें। बाहरी स्नान समाधान के साथ कक्ष भरें।

दोनों कार्बन फाइबर भरी हुई केशिकाओं को मंच माइक्रोमैनीपुलेटर में संलग्न करें और उन्हें एक कोण पर संरेखित करें ताकि कार्बन फाइबर मापने वाले कक्ष की सतह पर क्षैतिज के पास हों। यह जांचने के लिए कि क्या फाइबर सही ढंग से गठबंधन किए गए हैं, मापने वाले कक्ष की सतह पर ध्यान केंद्रित करें, पहले फाइबर को कम करें, और फाइबर को क्षैतिज रूप से स्थानांतरित करें। फाइबर की नोक मापने वाले कक्ष की सतह पर फिसलने वाली होनी चाहिए।

दूसरे फाइबर के लिए एक ही प्रक्रिया का पालन करें। रोशनी बंद के साथ, कक्ष में सुसंस्कृत सेल निलंबन की कुछ बूंदें जोड़ें और हरी रोशनी उत्तेजना के जवाब में अनुबंध करने वाली कोशिकाओं का चयन करने के लिए छोटी हरी बत्ती दालें लागू करें। पहले फाइबर को संलग्न करने के लिए, धीरे-धीरे फाइबर को कम करके सेल को सेक करें फिर दबाव छोड़ें।

दो फाइबर के बीच अधिकतम संख्या में सारकोमर्स रखने के लिए कार्डियोमायोसाइट के दूसरे छोर पर पहले एक के समानांतर दूसरा फाइबर संलग्न करें। दोनों फाइबर संलग्न होने के बाद, फाइबर उठाएं ताकि सेल अब कक्ष की सतह के संपर्क में न रहे। सरकोमर को ध्यान में लाएं, फाइबर के बीच सारकोमर लंबाई ट्रैकिंग विंडो सेट करें, और फाइबर झुकने को ट्रैक करने के लिए एज डिटेक्शन मॉड्यूल का उपयोग करें।

लाल और हरे रंग की खिड़कियों के साथ पता लगाने के क्षेत्रों सेट और प्रकाश तीव्रता ट्रेस के पहले व्युत्पन्न पर एक सीमा को परिभाषित। सरकोमेरे लंबाई और फाइबर झुकने पर नज़र रखते हुए ऑप्टिकल रूप से कोशिका को गति दें। इस मामले में, हम 0.25 हर्ट्ज पर पुस्तक।

कम से कम 15 ऑप्टिकली संकुचन रिकॉर्ड करने के बाद, क्षेत्र कोशिका को विद्युत रूप से उत्तेजित करता है। संकुचन प्राप्त करने के लिए सीमा का पता लगाएं और विद्युत पेसिंग के लिए दहलीज वोल्टेज 1.5 गुना लागू होते हैं। एक निषेध प्रोटोकॉल के लिए, संकुचन प्रकाश में लाना करने के लिए विद्युत उत्तेजनाओं को लागू करें और फिर विभिन्न प्रकाश तीव्रता पर एक निरंतर प्रकाश नाड़ी के लिए सेल का पर्दाफाश करें।

प्रकाश प्रेरित अवरोध के बाद कम से कम 15 संकुचन रिकॉर्ड करें। GtACR1 सुसंस्कृत खरगोश कार्डियोमायोसाइट्स में व्यक्त किया जाता है। 300 मिलीसेकंड के लिए चार मिलीवाट प्रति मिलीमीटर की हल्की तीव्रता पर GtACR1 फोटोएक्टिवेशन के परिणामस्वरूप बड़े आवक-निर्देशित धाराओं में शून्य से 74 मिलीवोल्ट्स पर 245 पिकोपेरे की मापा गया पीक करंट होता है।

इस प्रतिनिधि प्रयोग में, कार्रवाई क्षमता या तो वर्तमान इंजेक्शन के साथ विद्युत रूप से शुरू की गई थी १.५ बार दहलीज या ऑप्टिकल रूप से 10 मिलीसेकंड प्रकाश दालों के साथ । ऑप्टिकली पुस्तक कार्डियोमायोसाइट्स ने धीमी कार्रवाई संभावित शुरुआत का प्रदर्शन किया। विद्युत रूप से ट्रिगर की गई कार्रवाई क्षमता निरंतर प्रकाश के तहत बाधित थी।

उच्च वर्तमान इंजेक्शन और निरंतर प्रकाश आवेदन के दौरान सीमा से 1.5 गुना भी कार्रवाई क्षमता प्राप्त नहीं करते हैं। कार्डियोमायोसाइट ने विद्युत पेसिंग पर 232 माइक्रोन्यूटन प्रति मिलीमीटर और ऑप्टिकल पेसिंग के बाद 261 माइक्रोन्यूटन प्रति मिलीमीटर चुकता किया। लंबे समय तक हरी रोशनी दालों ने खरगोश कार्डियोमायोसाइट्स से डायस्टोलिक कैल्शियम हानि को ध्यान में रखते हुए कम संकुचन बल पैदा करने के बाद के अवरोध के साथ संकुचन को बाधित किया।

हम एक प्रयोग करने से पहले तकनीकों का अभ्यास करने की सलाह देते हैं, विशेष रूप से अंधेरे में माइक्रोप्रोब्स की स्थिति चुनौतीपूर्ण हो सकती है। कार्डियोमायोसाइट अनुबंध का विश्लेषण करते समय बहुत महत्वपूर्ण है क्योंकि यह बल उत्पादन और विश्राम को प्रभावित कर सकता है। आइसोटोनिक और ऑक्सोटोनिक संकुचन विश्लेषण के लिए विभिन्न आबूलोड भी लागू किए जा सकते हैं।

ये तकनीकें कार्डियोमायोसाइट्स में नव विकसित ऑप्टोजेनेटिक एक्ट्यूएटर को सक्रिय करने के जैव भौतिक प्रभावों के लक्षण वर्णन की अनुमति देती हैं जो प्रत्येक प्रयोग के लिए सबसे उपयुक्त ऑप्टोजेनेटिक उपकरण का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण है। कृपया ध्यान रखें कि एडेनोवायरस ट्रांसडक्शन और ट्रांसडक्शन के बाद के सभी कदम जैवसेफ्टी स्तर II शर्तों के तहत किए जाने चाहिए।