光遗传学调节心细胞活性的机电评估

使用该协议作为不同光遗传学执行器对心肌细胞活性的生物物理效应，可以进行测试，以帮助心脏组织和整个心脏的光遗传学实验的发展。通过将贴片夹紧技术与沙康跟踪和碳纤维辅助力测量相结合，我们可以研究GtoACR1光激活对心室心细胞的电和力学的影响。光遗传学抑制可能用于光学除颤。

GtACR1 是一种光遗传学工具，能够沉默心脏活动。该技术完全适用于其他研究领域，如平滑和单细胞肌肉细胞研究。虽然此协议不能用于高通量筛选，但它为心肌细胞机电功能的综合分析提供了手段。

所以如说，一张图片说了一千多个字。我们可以在视频中了解多少信息？我们的一些工具和技术涉及单一菌细胞拉伸和探头制备是非常复杂的，它更容易在视频中传达他们相比的描述。

血液从9到10周大的新西兰白兔的盐水中洗出后，将磷酸盐切换到低钙、高钾溶液，并在心脏停止跳动后将心脏多洗两分钟。将酶溶液吸收，在消化两分钟后开始将酶溶液重新循环回储液罐中，并在消化五分钟后将速度降低至每分钟16毫升。一旦组织在消化40-50分钟后出现软，切下心脏的管，并立即将心脏放在阻塞溶液中。

添加阻塞溶液，直到组织完全覆盖。切断右心室和隔膜，分离左心室。去除乳腺肌肉，使用细钳和移液器轻轻拉开组织，通过机械分离释放细胞。

用一毫米平方孔通过网格过滤细胞悬浮液，并通过离心沉淀细胞。然后在新鲜的阻尼溶液中重新暂停心肌细胞颗粒。对于贴片夹实验，在培养细胞之前，在培养皿中涂上每毫升层压素 100 微克的自动处理盖玻片。

对于碳纤维实验，在 95 到 5 的乙醇到水溶液中，每毫升 Poly-HEMA 中涂 0.12 克 Petri 盘。重新增殖心肌细胞后10至15分钟，去除上经剂，在培养基中重新暂停细胞。数数后，将细胞以每毫升1.75倍至4个细胞的目标密度，播种到培养皿的盖玻片上。

在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育三到四个小时。在孵育结束时，用含有腺病毒五型编码的新鲜介质替换盖玻色培养物，在感染率为 75 的 GacR1-eGFP 时进行。将培养物返回孵化器48小时。

要执行贴片夹紧实验，请使用微移管拉拔器从苏打石灰玻璃毛细管中拉出 1.7 至 2.5 兆赫的贴片移液器，并初始化数据采集软件。将带细胞的盖玻片放入含有外部溶液的测量室，并基于其eGFP荧光选择心肌细胞。接下来，用内部溶液填充贴片移液器，并将移液器连接到移液器支架上，将氯化银涂层银记录线插入内部溶液中。

将膜测试设置为应用 10 毫伏脉冲 15 毫秒，基线为零毫伏。达到单元连接配置后，切换到数据采集软件中保持电位为负 60 毫伏的整个单元模式。然后轻轻施加负压，通过破坏膜来访问整个细胞配置。

测量的电容立即增加，将证明破裂的成功。在负 74 毫伏的电压夹紧模式下记录光激活协议，光脉冲为 300 毫秒，在零皮安培的电流夹紧模式下记录作用电位。要生产碳纤维，请先将移液器安装到拉拔器的移液器支架上。

将玻璃毛细管拉入两个移液器，总锥形长度约为 11 毫米，最终内径约为 30 微米。接下来，使用立体显微镜在方向圆中对齐一个毛细管，然后用弯管向下推毛细管的尖端，将其弯曲到 45 度。加热灯丝，直到毛细管保持 45 度角，即使在去除弯管后。

弯曲毛细管后，使用装有软管的细钳将一根碳纤维从管子中拿出，并放入毛细管的细尖中。将毛细管中的纤维向上推至弯曲处。切割碳纤维，以便他们从毛细管的尖端投射两毫升，并使用氰丙烯酸酯胶水将纤维固定到每个毛细管的前部。

要校准纤维，请将一个毛细管连接到由微操纵器和压电电机控制的支架上。向传感器移动毛细管，使其相对于传感器对齐。将光纤尖端与力传感器接触，而不产生任何力。

压电电机的总运动量为60微米。将压电电机向力传感器移动六个 10 微米步。该传感器的灵敏度为每伏特 0.05 毫新吨，力范围为零至 0.5 毫新吨。

读取每个步骤的测量电压，并从传感器上去除碳纤维。要记录收缩心肌细胞的力，请用 Poly-HEMA 涂覆玻璃表面，然后放在测量室中。用外部沐浴液填充腔室。

将两个碳纤维加载的毛细管连接到级微操纵器，并按一定角度对齐它们，使碳纤维接近于测量室表面的水平。要检查纤维是否正确对齐，请聚焦在测量室的表面，降低第一根纤维，然后水平移动光纤。纤维尖端应滑动在测量室表面。

对第二根纤维遵循相同的步骤。关灯后，在腔室中加入几滴培养细胞悬浮液，并应用短的绿光脉冲来选择因绿灯刺激而收缩的细胞。要连接第一根纤维，请通过降低纤维轻轻压缩电池，然后释放压力。

将第二根纤维与心肌细胞另一端的第一根纤维平行，以便在两种纤维之间拥有最大数量的沙球。两个纤维连接后，抬起纤维，使电池不再与腔室表面接触。将沙眼聚焦，设置光纤之间的沙康长度跟踪窗口，并使用边缘检测模块跟踪光纤弯曲。

使用红色和绿色窗口设置检测区域，并在光强度跟踪的第一个导数上定义阈值。光学速度细胞，同时跟踪沙康长度和纤维弯曲。在这种情况下，我们以0.25赫兹的步伐。

在记录至少15次光学引出的收缩后，场以电刺激细胞。查找引出收缩的阈值，并应用 1.5 倍的阈值电压进行电起搏。对于抑制方案，应用电刺激来引起收缩，然后使细胞在各种光强度下暴露在持续的光脉冲下。

在光诱导抑制后记录至少15次收缩。GtACR1 用培养的兔子心肌细胞表达。GtACR1 光激活以每毫米四毫瓦的光强度（300毫秒）为单位，产生负74毫伏的大内向电流，测量的峰值电流为245皮安佩雷。

在这个具有代表性的实验中，用电流注入触发动作电位，其电流为阈值的1.5倍，或者用光学触发10毫秒光脉冲。光节奏心肌细胞表现出一种较慢的行动潜在发作。电触发作用电位在持续光线下被抑制。

在持续光应用期间，更高的电流注入和阈值的 1.5 倍不会产生作用电位。心肌细胞在电起搏时产生每毫米232微新顿的收缩力，在光学起搏后产生每毫米261微新顿的收缩力。长时间的绿光脉冲抑制收缩与抑制后复发收缩产生较低的收缩力，以符合兔子心肌细胞的舒张钙损失。

我们建议在进行实验之前练习这些技术，特别是因为在黑暗中放置微保护器可能具有挑战性。在分析心肌细胞收缩性时非常重要，因为它会影响力的产生和放松。各种后荷载也可用于同位素和辅助气收缩分析。

这些技术允许对激活心肌细胞中新开发的光遗传学执行器的生物物理效应进行表征，这对选择最适合每个实验的光遗传学工具至关重要。请注意，腺病毒转导和转导后的所有步骤应在生物安全II级条件下执行。