Elektromekanisk bedömning av optogenetiskt modulerad kardiomyocytaktivitet

Med hjälp av protokollet som en biofysisk effekt av olika optogenetiska ställdon på kardiomyocyte aktivitet kan testas till stöd i utvecklingen av optogenetiska experiment i hjärtvävnad och hela hjärtan. Genom att kombinera patch clamp tekniken med sarcomere spårning och kolfiber assisterad kraft mätningar, kan vi studera effekterna av GtACR1 photoactivation på el och mekanik av ventrikulära kardiomyocyter. Optogenetisk hämning kan potentiellt användas för optisk defibrillering.

GtACR1 är ett optogenetiskt verktyg som möjliggör ljuddämpning av hjärtaktivitet. Denna teknik är fullt tillämplig på andra forskningsfält såsom släta och encelliga muskelcellstudier. Även om detta protokoll inte kan användas för hög genomströmning screening, det ger ett medel för den omfattande analys av kardiomyocyte elektriska och mekaniska funktion.

Så som ordspråket säger, en bild säger mer än tusen ord. Hur mycket mer information kan vi komma över i video? Några av våra verktyg och tekniker som deltar i enda myocyte stretching och i sond beredning är mycket invecklad och det är mycket lättare att förmedla dem i en video jämfört med en beskrivning.

Efter att blodet har spolats ut ur saltlösningen genomsyras hjärtat från en nio till 10 veckor gamla Nya Zeeland vit kanin, växla perfusate till en låg kalcium, hög kalium lösning och genomsyra hjärtat i ytterligare två minuter efter hjärtat slutar slå. Genomsyra enzymlösningen, börja återcirkulera enzymlösningen tillbaka in i reservoaren efter två minuters matsmältning, och minska hastigheten till 16 milliliter per minut efter fem minuters matsmältning. När vävnaden verkar mjuk efter 40-50 minuters matsmältning, skär hjärtat av kanylen och omedelbart placera hjärtat i blockerande lösning.

Lägg till blockerande lösning tills vävnaden är helt täckt. Skär av höger kammare och septum och separera vänster kammare. Ta bort papillära muskler och använda fina tlycetter och en pipett för att försiktigt dra isär vävnaden för att frigöra cellerna genom mekanisk dissociation.

Filtrera cellupphängningen genom ett nät med en millimeters kvadrerade porer och sediment cellerna genom centrifugering. Sedan resuspend kardiomyocyte pelleten i färsk blockerande lösning. För ett plåsterklämexperiment, belägga autoklaverade täckslips i en Petri-rätt med 100 mikrogram per milliliter laminin omedelbart före cellodling.

För kolfiber experiment, coat Petri rätter med 0,12 gram per milliliter av Poly-HEMA i en 95-till-fem etanol-till-vatten lösning. Tio till 15 minuter efter resuspending kardiomyocyter, ta bort supernatant och återanvända cellerna i kultur medium. Efter att ha räknat, utsäde cellerna på en täckplatta i en petriskål med en måltäthet på 1,75 gånger 10 till de fyra cellerna per milliliter.

Inkubera kulturerna i tre till fyra timmar vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. I slutet av inkubationen, ersätta mediet från täckkollakulturerna med färskt medium som innehåller adenovirus typ fem kodning för GtACR1-eGFP vid en multiplicity av infektion av 75. Återför kulturerna till inkubatorn i 48 timmar.

För att utföra ett patch clamp experiment, använd en micropipette puller att dra 1,7 till 2,5 megaohm patch pipetter från soda lime glas kapillärer och initiera datainsamling programvara. Placera en täckplatta med celler i mätkammaren som innehåller extern lösning och välj kardiomyocyten utifrån dess eGFP fluorescens. Därefter fyll en patchpipett med intern lösning och fäst pipetten på pipetthållaren som sätter in silverkloridbelagd silverinspelningstråd i den interna lösningen.

Ställ in membrantestet så att det ska tillämpas 10 millivoltpulser under 15 millisekunder med en baslinje på noll millivolt. Efter att ha nått den cellfästa konfigurationen, växla till hela cellläge med en innehavspotential på minus 60 millivolt i datainsamlingsprogramvaran. Sedan försiktigt tillämpa undertryck för att komma åt hela cellen konfigurationen genom rupturing membranet.

En lyckad bristning kommer att bevisas av en omedelbar ökning av den uppmätta kapacitansen. Registrera fotoaktiveringsprotokoll i spänningsklämläge vid minus 74 millivolt med ljuspulser på 300 millisekunder eller åtgärdspotentialer i aktuellt klämläge vid noll picoampere. För att framställa kolfibrerna monterar du först pipetten på dragsläparnas pipetthållare.

Dra glaskamillärerna i två pipetter med en total avsmalnande längd på cirka 11 millimeter och en slutlig innerdiameter på ca 30 mikrometer. Använd därefter ett stereomikroskop för att rikta in en kapillär i orienteringscirkeln och böj den med upp till 45 grader genom att trycka ner på kapillärens spets med en bender. Värm upp glödtråden tills kapillären bibehåller 45 graders vinkel även efter att bändaren avlägsnats.

Efter böjning av kapillären, använd fina tlyck försedda med mjuka slangar för att ta en kolfiber ur röret och passa in den i den fina spetsen av kapillären. Tryck fibern i kapillären upp till böjen. Skär kolfibrerna så att de projekt två milliliter från toppen av kapillären och använda cyanoakrylat lim för att fixera fibrerna till den främre delen av varje kapillär.

För att kalibrera fibrerna, fäst en kapillär till en hållare som styrs av en mikromanipulator och en piezomotor. För kapillären mot sensorn och rikta den i förhållande till sensorn. Placera fiberspetsen i kontakt med kraftsensorn utan att producera någon kraft.

Piezomotorns totala rörelse är 60 mikrometer. För piezomotorn i sex 10 mikrometersteg mot kraftsensorn. Sensorn har en känslighet på 0,05 millinewtons per volt och en kraft räckvidd på noll till 0,5 millinewtons.

Läs ut den uppmätta spänningen för varje steg och ta bort kolfibern från sensorn. För att registrera kraften i upphandlande kardiomyocyter, belägga ytan av ett täckglas med Poly-HEMA och placera den i mätkammaren. Fyll kammaren med extern badlösning.

Fäst både kolfiber lastade kapillärer till scenen mikromanipulator och rikta dem i en vinkel så att kolfibrerna är nära horisontella till ytan av mätkammaren. För att kontrollera om fibrerna är korrekt inriktade, fokusera på ytan av mätkammaren, sänka den första fibern, och flytta fibern horisontellt. Fiberns spets ska vara glidande på mätkammarens yta.

Följ samma procedur för den andra fibern. Med ljuset släckt, tillsätt några droppar odlade cellupphängning till kammaren och applicera korta gröna ljuspulser för att välja celler som kontrakt som svar på den gröna ljusstimuleringen. För att fästa den första fibern, försiktigt komprimera cellen genom att sänka fibern sedan släppa trycket.

Fäst den andra fiberparallellen till den första i den andra änden av kardiomyocyten för att få ett maximalt antal sarkomer mellan de två fibrerna. Efter att båda fibrerna är fastsatta lyfter du fibrerna så att cellen inte längre är i kontakt med kammarytan. Sätt sarkomerna i fokus, ställ in sarkomerlängdsspårningsfönstret mellan fibrerna och använd kantdetekteringsmodulen för att spåra fiberböjningen.

Ställ in detekteringsområdena med de röda och gröna fönstren och definiera en tröskel vid det första derivatet av ljusintensitetsspårningen. Optiskt takt cellen samtidigt spåra sarkomere längd och fiber böjning. I det här fallet stegade vi på 0,25 hertz.

Efter att ha spelat in minst 15 optiskt framkallade sammandragningar, fält stimulera cellen elektriskt. Hitta tröskeln för att framkalla sammandragningarna och applicera 1,5 gånger tröskelspänningen för elektriskt tempo. För ett hämningsprotokoll, applicera elektriska stimuli för att framkalla sammandragningar och utsätt sedan cellen för en ihållande ljuspuls vid olika ljusintensiteter.

Registrera minst 15 sammandragningar efter ljusinducerad hämning. GtACR1 uttrycks i odlade kanin kardiomyocyter. GtACR1 fotoaktivering vid en ljusintensitet på fyra milliwatt per millimeter i kvadrat i 300 millisekunder resulterar i stora inåtriktade strömmar på minus 74 millivolt med en uppmätt toppström på 245 picoampere.

I detta representativa experiment utlöstes aktionspotentialer antingen elektriskt med ströminjektioner 1,5 gånger tröskeln eller optiskt med 10 millisekkunders ljuspulser. Optiskt tempo kardiomyocyter visat en långsammare åtgärder potential debut. Elektriskt utlösta aktionspotentialer hämmades under ihållande ljus.

Högre ström injektioner och 1,5 gånger tröskeln under den ihållande ljus ansökan inte heller framkalla åtgärder potentialer. Kardiomyocyten genererade en sammandragning kraft 232 micronewtons per millimeter kvadrat på elektriska pacing och 261 micronewtons per millimeter kvadrat efter optiska pacing. Långvarig grönt ljus pulser hämmade sammandragningarna med post-hämning reoccurring sammandragningar genererar en lägre kontraktil kraft i linje med den diastoliska kalciumförlust från kanin kardiomyocyter.

Vi rekommenderar att öva på teknikerna innan du utför ett experiment, särskilt som positionering av mikrosonder i mörkret kan vara utmanande. är mycket viktigt när man analyserar kardiomyocyte kontraktilitet eftersom det kan påverka kraftproduktion och avkoppling. Olika afterloads kan också tillämpas för isoton och auxotonic kontraktion analys.

Dessa tekniker möjliggör karakterisering av de biofysiska effekterna av att aktivera nyutvecklade optogenetiska ställdon i kardiomyocyter vilket är avgörande för att välja det mest lämpliga optogenetiska verktyget för varje experiment. Var medveten om att adenovirustransduktion och alla steg som följer transduktionen bör utföras under förhållanden på biosäkerhetsnivå II.