Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
מדידה כמותית של מתוך מסונתז חלבונים בעכברים
Chapters
Summary November 29th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
רמת החלבון של נוזל השדרה הגבוה יכול להיות תוצאה של דיפוזיה של חלבון פלזמה על פני מחסום דם-מוח שונה או סינתזה התוך. פרוטוקול בדיקה מיטבי מוצג במאמר זה, המסייע להפלות את שני המקרים ומספק מדידות כמותית של חלבונים מסונתז באופן פנימי.
Transcript
פרוטוקול זה מאפשר CSF ואיסוף דם בתיקון כמותי של רמות חלבון CSF למדוד לתוך סינתזת חלבון thecal במודלים העכבר של הפרעות נוירולוגיות. הליך זה מספק בסיס, שנגדו ניתן להעריך את המקור הפתופיזיולוגי של חלבוני CSF בעלי עניין, ואת היציבות והמשמעות התפקודית של שלמות העדפת CSF בדם. ניתוח סינתזת חלבונים בין-תת-חיים ושלמות מחסום יכול להיות מיושם על מודלים אחרים של בעלי חיים ועל מחקרים בבני אדם.
לדוגמה, כדי לבדוק מחלות של מערכת העצבים המרכזית. איסוף כמויות משמעותיות של CSF נקי יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית בעכברים, כך תרגול הטכניקה עד כמויות גדולות של מדגם לא מזהם ניתן להשיג מומלץ. הדגמת ההליכים תהיה מיכאל לינזי, סטודנטית לתואר שני מהתוכנית ברפואה ניסויית ומולקולרית בדארטמות', בקבוצת המחקר החדשה שלנו לאימונולוגיה.
לאיסוף סרום באמצעות דימום מסלולי רטרו. לאחר אישור חוסר תגובה רפלקס הדוושה בעכבר הרדמה יותר מ 15 גרם, לתפוס את העור הרופף מאחורי האוזניים עם האגודל והאצבע המורה של היד הלא דומיננטית, ולהשתמש באצבע המורה כדי למשוך בחזרה את העור מעל העיניים. באמצעות האגודל כדי למשוך בחזרה את העור מתחת לעיניים, מניחים את הקצה של פיפטה פסטר, מוחזק בזווית של כ 45 מעלות, לתוך ארובת העין מתחת לעין, מכוון לכיוון אמצע ארובת העין, תוך סיבוב פיפטה בין האצבעות.
לאחר מכן להחיל קצר, לחץ עדין ולשחרר כדי לאפשר לדם להיכנס פיפטה. כאשר דגימת הדם נאספה, בעדינות להסיר את נימי מבלי לפגוע בעין, ולהעביר את הדם לצינור צנטריפוגה 1.5 מיליליטר. לאחר סגירת העפעף, יש להפעיל לחץ קל עם גזה כדי למנוע דימום נוסף.
אפשר לדם לקריש במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר לפני סיבוב המדגם על ידי צנטריפוגה. באמצעות טכניקת פיפטה נקייה, לאסוף את הסרום המופרד לתוך בקבוקון חדש, שכותרתו 500 microliter, ומיד להקפיא את הנסיוב ב 80 מעלות צלזיוס. לאחר אישור חוסר התגובה רפלקס הדוושה, להסיר שטח גדול מספיק של שיער כדי לאפשר איסוף של נוזל השדרה המוחי מיד בקצה caudal של הגולגולת של העכבר הרדמה.
מקם את העכבר במצב נוטה בהתקן סטריאטוקסי בתנאים סטריליים, וייצב את הראש עם מוטות אוזניים. ספוגית באתר כירורגי עם 30% ניקוד chlorhexidine, ולעשות חתך בעור קשתית נחותה occiput לחשוף את השרירים overlying מגנה cisterna. באמצעות מדפים, קהה לנתח את הרקמה התת עורית והשרירים, ולהשתמש מפשקים מיקרו להחזיק את השרירים זה מזה כדי לחשוף את שכבת קרום המוח דורה מאטר מעל מגנה cisterna.
לשטוף בעדינות את הרקמה עם PBS סטרילי כדי להסיר כל זיהום דם אפשרי, ולהשתמש ספוגית כותנה סטרילית כדי להניף את דורה מאטר יבש. מיקום הנקב הראשוני ב- cisterna magna חיוני להשגת CSF בשפע, לא מזוהם. באמצעות מחט 30 מד, בעדינות לנקב את הממברנה המכסה את מגנה cisterna, ובמהירות בעדינות להכניס צינור נימי זכוכית קטן לתוך הדקירה.
כאשר נאספו חמישה עד 12 מיקרוליטרים של CSF, הסר בזהירות את הצינור מהממברנה ולהשתמש בחתיכת צינורות פוליאתילן כדי לחבר את הצינור למזרק שלושה מיליליטר. להזריק את CSF שנאסף לתוך צינור microliter שכותרתו 500 על קרח, ולהשתמש מחט חד פעמית ותפרים polydioxanone מגוונים כדי לסגור את החתך. נקו את האזור של כל דם או רקמה מיובשים, והם מניחים את העכבר בכלוב נקי וחם עם ניטור עד ל recumbency מלא.
לאסוף את CSF על ידי צנטריפוגה, ולבדוק חזותית את גלולה ולנפח אותו עבור כל סימנים של זיהום דם. לאחר מכן, באמצעות טכניקת פיפטה נקייה, להעביר את supernate המכיל CSF לתוך צינור 200 microliter חדש, ולדלל את CSF ביחס אחד עד שלושה עם PBS לאחסון מיידי ב 80 מעלות צלזיוס. לאיסוף סרום על ידי ניקוב לב, מיד לאחר אוסף CSF, כפי שהודגם רק, מניחים את העכבר במצב supine.
ספוגית את עור הבטן עם 70% אלכוהול. השתמש במספריים כדי לפתוח את חלל בית החזה, לחשוף את הלב, ולהכניס מחט מד 25 מחובר מזרק 3 מיליליטר לתוך החדר השמאלי. לאחר מכן בעדינות להחיל לחץ שלילי על הבוכנה מזרק, משיכת המחט לאחר הדם נאסף.
לדכא את הבוכנה כדי להוציא את הדם שנאסף לתוך בקבוקון 1.5 מיליליטר. עכשיו, לאפשר לדם לקריש במשך 30 עד 60 דקות בטמפרטורת החדר לפני הפרדת הנסיוב על ידי צנטריפוגה. לאחר מכן, באמצעות טכניקת פיפטה נקייה, להעביר את הסרום לתוך בקבוקון חדש שכותרתו 500 microliter לאחסון מיידי ב 80 מעלות צלזיוס.
כדי לכמת את חלבוני היעד ואת האלבום בדגימות תואמות של סרום ו- CSF, השתמשו בהסטת כימות חלבון סטנדרטית, תוך שימוש בחלבונים סטנדרטיים מוזכרים להכנת עקומה סטנדרטית לכל חלבון מעניין. לאחר הניתוח, לייצא את הנתונים הגולמיים לתוכנית גרפים תוכנה מתאימה, גרף עוצמת פלואורסצנטיות אות זיהוי לעומת ריכוזי החלבון הסטנדרטיים כדי ליצור עקומה סטנדרטית עבור כל חלבון של עניין. לאחר מכן, השתמש בעקומות הסטנדרטיות כדי לחשב את הריכוזים של כל אנליט של עניין בדגימות.
לבסוף, השתמש בריכוזי אלבומן ואנליט יעד כדי לחשב ערכי Q ואינדקס תוך-תיאטרלי. הרמות בפועל של IgG הכולל גדלים באופן משמעותי ב- CSF של שני מודלים מכרסמים שנבדקו של טרשת נפוצה, לעומת הגיל המתאים פקדים מזויפים. עכברי R-EAE מציגים ערכי אלבום משופרים באופן משמעותי, המצביעים על חדירות מוגברת של מחסום מוח הדם בעכברים אלה.
באופן לא הפוך, אין הבדלים במנה אלבומן קיים בין TMEV-IDD ועכברים מזויפים, מאשש ממצאים קודמים של מחסום שלם בעכברים TMEV-IDD. בנוסף, בבעלי חיים TMEV-IDD, ערכי מדד IgG גבוהים משמעותית ולכן, ייצור IgG תוך-פתאי נצפים. החישוב של אינדקס חלבונים מאפשר זיהוי של סמנים ביולוגיים חדשניים של חלבונים שימושיים לאבחון מוקדם, חיזוי תוצאות וניטור קורסי מחלות הן למחלות נוירו-פתיתיות והן למחלות נוירודגנרטיביות.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
