Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
ייצור של שפעת מדבקת גבוהה-Titer חלקיקים מוקלדים עם מעטפה גליקורופנס מH5N1 פתוגניים מאוד H7N9 וירוסים העופות
Chapters
Summary January 15th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסיוני כדי לייצר מעטפת מדבקת ויראלי מידבקת (עמ') עם גליקורופנים מעטפות משתי שפעת זנים וכיצד לקבוע את הנגועים. פרוטוקול זה מאוד להתאמה כדי לפתח pps של כל סוג אחר של וירוסים עטוף עם מעטפה שונה גליקורופנס.
Transcript
טכניקה זו של ייצור PP ויראלי שפעת וקביעת זיהומיות שלה יכול לפשט את המחקר של וירוס שפעת בעיר BSL-2. נרמלנו את PPS עבור זיהומים המבוססים על נתוני qRT-PCR של PPS. שני פלסמיד ביטוי גליקופרוטאין מקודדים, אשר יכול לפשט את המחקר על שיוך וירוס.
יום אחד לאחר זריעת התא, בדוק את מורפולוגיה התא וצפיפות תחת מיקרוסקופ אור הפוך. באופן אידיאלי התא צריך להיות כ 85%confluent ב transfection. החלף את המדיום עם מיליליטר אחד של DMEM ללא סרום לגם, והחזר את הצלחת לאנקובטור.
כדי שכל באר של תאים תחולף, לדלל שמונה microliters של reagent transfection לנפח של 150 microliters עם מדיום סרום מופחת. מערבבים את הפתרון בעדינות ולתת לו לשבת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. בינתיים, לדלל 2.5 מיקרוגרם של DNA פלסמיד לתוך 158 microliters של מדיום סרום מופחת.
לאחר הדגירה של חמש דקות, מערבבים את הדנ"א המדולל עם רגנט טרנספיקציה מדולל, מערבבים בעדינות את הפתרון ומשאירים אותו בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. מוסיפים את קומפלקס השומנים DNA ל בארות המתאימות עם התאים במדיום ללא סרום. ואז מערבבים את הצלחת בעדינות על ידי נדנדה קדימה ואחורה.
דגירה הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני במשך ארבע עד שש שעות. לאחר הדגירה, להסיר את המדיום ולהחליף אותו עם שני מיליליטר של DMEM לגם. ואז לה הדגירה אותו לעוד 36 עד 48 שעות.
זרע כל סוג של תא רגיש ב 10, 000 תאים ל הבאר וצלחת 96 גם. ואז להשאיר את הצלחת במשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים חממת פחמן דו חמצני. ביום השלישי לאחר transfection, לבדוק את הצבע של המדיום אשר צריך להאיר ורוד או כתום מעט ולבחון את התאים עם מיקרוסקופ ביולוגי פלורסנט הפוך תחת 440 כדי 460 אורך גל ננומטר.
ב 38 עד 48 שעות לאחר transfection, לקצור את החלקיקים פסאודוטריד או PPS על ידי עובר אותם דרך 0.45 מיקרומטר פוליווינילידין פלואוריד מסנן פלואוריד כדי לחסל פסולת התא, ולאחר מכן לחלק אותם אליקים נפח קטן ולאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כדי לכמת את PPS, להעביר 30 microliters של חלקיקים נגיפיים מטוהרים לצינור 1.5 microliter RNase חינם ולהוסיף מיקרוליטר אחד של נקלאז Benzonase. דגירה הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי לחסל כל זיהום DNA ו- RNA.
לאחר הדגירה, להקפיא את המדגם למינוס 70 מעלות צלזיוס כדי פעיל את הגרעין ולהוסיף שני microliters של Proteinase K.Incubate את התערובת במשך 30 דקות כדי לעכל את חלבוני המעטפה ולשחרר את CMV-GFP RNA. ואז לא פעיל פרוטאינאז K ב 100 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות. לכמת את PPS עם תמלול הפוך כמותי RTPCR באמצעות בדיקה אוניברסלית צעד אחד RT-qPCR קיט פריימרים ובדיקות שצוין בכתב היד טקסט.
לנרמל את PPS לארבע פעמים 10 עד עותקי RNA החמישי למיליליטר. לאחר מכן להוסיף TPCK-טריפסין לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לתוך PPS כי הנמלים H7N9 hemagglutinin. הדגירה PPS ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי ליצור את תת היחידות הפונקציונליות HA1 ו HA2.
מערבבים את PPS מנורמל עם מדיום DMEM ביחס אחד לאחד, ואז להביא את הצלחת המכילה תאים רגישים לארון biosafety. שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים פעם אחת עם 100 מיקרוליטרים של PBS מחומם מראש. הוסף 100 מיקרוליטרים של תערובת PPS-DMEM לתוך כל באר, שידל את בדיקות ההינקות של כל סוג של PPS לקו תא רגיש אחד.
דגירה הצלחת במשך ארבע עד שש שעות ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר מכן שאפו את העל-טבעי והחליפו אותו ב-100 מיקרוליטרים של DCM, הדגירה את הצלחת למשך 24 עד 36 שעות נוספות לפני זיהוי הזיהום. התוצאות שלנו הן PPS נחשבים עכשיו זיהומיות לאנשים.
אז נהלי שמירה הכרחיים מומלץ לקחת כגון לבישת מסכה וביצוע בדיקות דביקות ב ארון biosafety. פרוטוקול זה יוצר כדי ליצור 10 סוגים של חלקיקים מדומה או PPS עם שני המגלוטין מקובצים ונוירמינידאז וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין או לא מעטפת גליקופרוטאינים. PPS דימוי עם מיקרוסקופ אלקטרונים שידור ואת ההדביקות שלהם הוערכו בשני קווי תאים, A549 ו MDCK.
בקבוצת PPS המכילה H5, ההידביקות של H5N1, H5 plus N9 ו- H5 הייתה כ- 90%18% ו- 10% עבור קו התא A549 ו- 40%5% ו- 5% עבור MDCK, בהתאמה. בקבוצת PPS המכילה H7, ההידביקות של H7N9, H7 plus N1 ו- H7 הייתה כ- 10%7% ו- 1%עבור קו התא A549 ו- 8%4%ו- 1%עבור MDCK, בהתאמה. ההדלקה של וירוס stomatitis כלי דם G גליקופרוטאין PP היה כ 21% עבור A549 ו 16% עבור תאי MDCK.
בעוד מעטפת הדלתא גליקופרוטאינים PP לא הראה שום להדביק. זה קריטי לזכור כי יצרנית PP HEK-293T/17 תאים מהווים את הבסיס של הליך זה. אז הצמיחה האופטימלית מלמדת אותנו שתאי HEK-293T/17 הם החשובים ביותר.
בעקבות הליך זה או בדיקה אחרת כגון L2 פתוח הבדיקה התוחמת ניתן לבצע. ההתדגם הזה כמעט יכול לפטור את המוזרויות הביולוגיות של העדפת הקולטן והתבנית תחשוף את הטרופוליזם של PPS. מאז שהם לקחו את הגליקופרוטאינים מנגיף שפעת משובטים לשניים פלוס מקסימום.
HA וחלבוני NA ניתן ללמוד בנפרד ולכן אנו reassortment ביניהם. ניתן לחקור את המוטנטים ואת ההשפעות הבוגרות.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
