Ex vivo trykbærende Hippocampal kapillar-Parenchymal arteriole forberedelse til funktionel undersøgelse

Vores metode gør det muligt at studere blodkar placeret i strukturer, der ellers ville være svært at billedet i Vivo, såsom hippocampus. Fordi blodkarrene er fjernet fra hjernevævet, signalering mellem kapillærer og arteriole kan studeres uden off-target effekter på det omgivende væv. For at isolere hippocampus, bruge små dissektion saks til at skære huden langs midterlinjen i toppen af hovedet af musen og flytte huden til siderne.

Start ved caudal side af kraniet, skære kraniet langs midterlinjen, indtil olfaktoriske pærer er nået og fjerne dele af kraniet, indtil cerebrum er udsat. Start nær næsen af musen, langsomt fjerne hjernen, ved hjælp af saks til at skære gennem olfaktoriske pærer, kranienerver, og rygmarv. Nedsænk hjernen, ventrale side ned i MOPS Buffered Saltvand, i midten af en dissektion plade, og placere pladen under en dissektion mikroskop.

Hold den skarpe kant parallelt med bunden af skålen, bruge barberbladet til at skære hjernen i halve langsgående revne i ét slag. Placer en halvkugle i midten af pladen med midterlinjen vender nedad og skub barberbladet lige gennem vævet langs den tværgående revne for at fjerne lillehjernen og hjernestammen. Roter halvkuglen, så den mediale side vender opad og bruge en spatel til at holde hjernen på plads.

Indsæt spidsen af en anden spatel under corpus callosum, scooping under vævet for at fjerne thalamus, septum, og hypothalamus fra hippocampus. Hippocampus bør nu være synlig som en buet struktur nær den bageste side af cerebrum. Brug en spatel til at holde cerebrum på plads, skal du bruge den anden spatel til at øse hippocampus ud af cerebrum.

Overfør derefter hippocampi til en ny dissektionsplade, fyldt ca. halvvejs med frisk MOP-opløsning. For hippocampal arteriole isolation, placere små stifter i hver ende af en hippocampus at sikre prøven hippocampal arterie side op. Brug meget skarpe snævler, forsigtigt strække små dele af hippocampi at løsne vævet omkring arterioler.

Og søg gennem de dorsale hippocampal væv for at identificere de eksterne tværgående arterier. Når arterien er blevet placeret, grab den eksterne tværgående arterie fra hippocampus og langsomt trække det væk fra vævet til at indsamle arterioler og kapillærer. Arterien fra hver hippocampus fjernes separat.

Når der ikke er flere beholdere, der skal fjernes, skal prøverne på isen sættes i gang, og det resterende hippocampalvæv kasseres. For cannulation af arterioler, lokalisere og arteriole med en gren, der ender med kapillærer og placere arteriole i et organ kammer. Skub forsigtigt kanylespidsen gennem arterievæggen under målområdet for at montere blodkarret.

Skub derefter forsigtigt fartøjet på kanylen, indtil der er nok væv til at placere slipset. Brug 12-0 nylon suturer til at gøre en løs knude, der vil passe over blodkar og kanyle, og bruge en halv hitch knude til at sikre båndene, trække enderne til at stramme knuden for at sikre arterien til kanylen. Fastgør et andet slips i den anden ende af arteriole at forsegle den.

På den modsatte side af kammeret, sænke en anden kanyle, indtil det punkt af kanylen stifter ned slips på enden af arteriel. Brug derefter en tredje kanyle til at fastgøre kapillær grenen til dækslet, og placere spidsen tæt på enden af grenen, mens enderne af kapillærerne udsættes. Da hjernen mikrocirkulationen er udsøgt skrøbelig, skal du sørge for at minimere strækning og håndtering af fartøjerne under cannulation procedure for at sikre overlevelsen af arteriolerne.

For tryk myografi analyse, overføre kammeret til et lys mikroskop fase med optagelse software og forbinde ind-og udstrømning slange til kammeret for overflod. Start den overflod med 37 grader Celsius Kunstig cerebrospinalvæske ved en fire milliliter per minut strømningshastighed, og fastgør trykdylen til peristaltisk pumpe parret med en tryktransducer. Bring det interne tryk til 20 millimeter kviksølv og start optagelsessoftwaren.

Juster mikroskopet og billedindstillingerne for at opnå det klareste billede. Og brug Edge Detection software til at kontrollere, at arterien er omkring 15 til 30 mikrometer i diameter, når det er fuldt udvidet. Når indstillingerne er blevet optimeret, skal du begynde optagelsen og øge det intravaskulære tryk i karret op til 40 millimeter kviksølv, mens du registrerer arteriediameteren med Edge Detection-softwaren.

Derefter kraftig kammeret i 15 til 20 minutter for at vaske ud MOP løsning. For at teste fartøjets levedygtighed skal der anvendes en mikromolar NS309-opløsning på badets overflod, arteriesegmentet skal spile, hvilket viser en 30 til 40% myogen tone. Når baseline tonen for arteriole er blevet etableret, bruge et glas puller at gøre kanyler med et fint punkt i den ene ende, og bruge kraftberne til at bryde spidsen af hver kanyle, således at stoffet af interesse kan flyde jævnt gennem spidsen på fem pounds af tryk per kvadrattomme.

Fyld kanylen med det stof af interesse. Og læg kanylen på en treakset mikromanipulator, der er fastgjort til mikroskopet. Tilslut slangen fra trykudslyngningssystemet til kanylen, og sænk langsomt kanylen ned i badet nær kapillærerne, idet du skal passe på ikke at ramme nogen del af fartøjet eller kammeret.

For at stimulere kapillærerne skal du sænke kanylen til dækslet lige ved siden af kapillærerne og aktivere trykudslyngningssystemet med den ønskede udslyngningstid. Ved slutningen af stimuleringen hæves kanylen en smule for at undgå yderligere stimulering. For at bekræfte, at kun kapillærerne blev stimuleret, skal du fylde den nye kanyle med en mikromolar NS309-opløsning og stimulere kapillærerne som påvist.

Derefter opnås den maksimale vasodilatation ved at bade præparatet med calciumfri opløsning. Bad anvendelse af en en mikromolar NS309 forårsager en næsten maksimal udvidelse af arteriole på grund af calcium-følsomme kalium kanaler i endotel. Kapillær endotelceller mangler imidlertid ikke mellemliggende og små ledningsevnekanaler og hyperpolariserer ikke som reaktion på agonisten, som følge heraf stimulerende kapillær ender med NS309, ikke forårsager opstrøms arteriolar dilatation, dette indikerer, at NS309 ikke nåede arterielen, og kan bruges som en kontrol for at få adgang til spacial begrænsning af sammensat anvendes på kapillærer ved tryk.

Ved hjælp af hippocampal kapillær parenkymal arteriel præparat som påvist, anvendelse af en kunstig cerebrospinalvæske suppleret med 10 millimolar kalium til kapillær ender, resulterer i en opstrøms arteriolar dilatation, der ikke adskiller sig mellem præparater fra mandlige og kvindelige mus. Endvidere, tilsætning af Kir2-hæmmer ML 133, stort set afskaffer kapillær induceret arteriel dilatation, som reaktion på 10 millimolar kalium i præparater fra både mandlige og kvindelige mus. Når montering af blodet vesssel, begrænse direkte interaktioner med blodkar for at minimere skaderne på, og øge levedygtigheden af fartøjet.

Når blodkarrene er blevet isoleret, forskellige lægemiddelforbindelser kan testes eller blodkarrene kan yderligere behandles for oliecular biologi, immunkemi, eller elektrofysiologi undersøgelser.