Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ex vivo onder druk Hippocampal capillaire-parenchymale Arteriole voorbereiding voor functionele studie
Chapters
Summary December 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Het huidige manuscript laat zien hoe hippocampal arteriolen en haarvaten van de muis hersenen isoleren en hoe ze onder druk kunnen worden gezet voor myografie, immunofluorescentie, biochemie en moleculaire studies.
Transcript
Onze methode maakt het mogelijk om bloedvaten te bestuderen in structuren die anders moeilijk in vivo te beeld krijgen, zoals de hippocampus. Omdat de bloedvaten uit het hersenweefsel worden verwijderd, kan de signalering tussen de haarvaten en de arteriole worden bestudeerd zonder off-target effecten op het omliggende weefsel. Om de hippocampus te isoleren, gebruik je een kleine dissectieschaar om de huid langs de middellijn aan de bovenkant van het hoofd van de muis te snijden en de huid naar de zijkanten te verplaatsen.
Vanaf de staartzijde van de schedel snijdt u de schedel langs de middellijn totdat de reukbollen zijn bereikt en verwijder delen van de schedel totdat de cerebrum wordt blootgesteld. Beginnend in de buurt van de neus van de muis, langzaam verwijderen van de hersenen, met behulp van de schaar te snijden door de olfactorische bollen, craniale zenuwen, en ruggenmerg. Dompel de hersenen onder, ventrale kant naar beneden in MOPS Gebufferd Saline, in het midden van een dissectie plaat, en plaats de plaat onder een dissectie microscoop.
Houd de scherpe rand parallel aan de bodem van de schotel, gebruik scheermesje om de hersenen in de helft langs de longitudinale fissuur in een slag te snijden. Plaats een halfrond in het midden van de plaat met de middellijn naar beneden en duw het scheermesje dwars door het weefsel langs de dwarse spleet om het cerebellum en de hersenstam te verwijderen. Draai het halfrond, zodat de mediale kant naar boven gericht en gebruik een spatel om de hersenen op zijn plaats te houden.
Steek het puntje van een tweede spatel onder het corpus callosum, scheppen onder het weefsel om de thalamus, septum, en hypothalamus te verwijderen uit de hippocampus. De hippocampus moet nu zichtbaar zijn als een gebogen structuur in de buurt van de achterste kant van de cerebrum. Met behulp van een spatel om de cerebrum op zijn plaats te houden, gebruik de tweede spatel om de hippocampus uit de cerebrum te scheppen.
Breng de hippocampi vervolgens over naar een nieuwe dissectieplaat, ongeveer halverwege gevuld met een verse MOP-oplossing. Voor hippocampal arteriole isolatie, plaats kleine pinnen aan elk uiteinde van een hippocampus om het monster hippocampal slagader kant omhoog te beveiligen. Met behulp van zeer scherpe tangen, voorzichtig strekken kleine delen van de hippocampi om het weefsel rond de arterioles los te maken.
En zoek door de rug hippocampal weefsels om de externe dwarse slagaders te identificeren. Wanneer de slagader is gelokaliseerd, pak de externe dwarsslagader van de hippocampus en trek het langzaam weg van het weefsel om de slagaders en haarvaten te verzamelen. De slagader van elke hippocampus wordt apart verwijderd.
Wanneer er geen vaten meer verwijderd moeten worden, plaatst u de monsters op ijs en gooi u het resterende hippocampale weefsel weg. Voor cannulation van de arterioles, lokaliseren en arteriole met een tak die eindigt met haarvaten en plaats de arteriole in een orgelkamer. Duw de canulepunt voorzichtig door de arteriole wand onder het doelgebied om het bloedvat te monteren.
Schuif het vat vervolgens voorzichtig op de canule totdat er voldoende weefsel is waarop de das kan worden gevonden. Gebruik 12-0 nylon hechtingen om een losse knoop te maken die over het bloedvat en canule past, en gebruik een halve kink in de kabel om de banden te beveiligen, trek de uiteinden om de knoop aan te scherpen om de arteriole aan de canule te beveiligen. Zet een andere das aan de andere kant van de arteriole om het te verzegelen.
Aan de andere kant van de kamer, lager een tweede canule tot het punt van de canule pinnen vaststelling van de das aan het einde van de arteriole. Gebruik vervolgens een derde canule om de haarvaten aan de coverslip te vastpinnen, waarbij de punt dicht bij het einde van de tak wordt plaatsgelegd, terwijl de uiteinden van de haarvaten worden blootgesteld. Als de hersenen microcirculatie is prachtig kwetsbaar, zorg ervoor dat het uitrekken en hanteren van de vaten te minimaliseren tijdens de cannulation procedure om de overleving van de arterioles te garanderen.
Voor druk myografie analyse, breng de kamer naar een lichtmicroscoop stadium met opnamesoftware en sluit de in- en uitstroom buizen aan de kamer voor overvloed. Start de overvloed met 37 graden Celsius Kunstmatige cerebrospinale vloeistof op een vier milliliter per minuut stroomsnelheid, en bevestig de druk canule aan peristaltische pomp in combinatie met een druktransducer. Breng de interne druk op 20 millimeter Mercurius en start de opnamesoftware.
Pas de microscoop en de beeldinstellingen aan om een zo duidelijk mogelijk beeld te bereiken. En gebruik de Edge Detection-software om te controleren of de arteriole ongeveer 15 tot 30 micrometer in diameter is wanneer deze volledig verwijd is. Zodra de instellingen zijn geoptimaliseerd, begint u met de opname en verhoogt u de intravasculaire druk in het vat tot 40 millimeter Mercurius, terwijl u de arteriooldiameter registreert met de Edge Detection-software.
Maak vervolgens 15 tot 20 minuten gebruik van de kamer om de MOP-oplossing uit te wassen. Om de levensvatbaarheid van het vat te testen, breng een micromolar NS309-oplossing aan op de badoverdaad, moet het arteriolarsegment verwijden, wat een myogene tint van 30 tot 40% aantoont. Zodra de basistoon voor de arteriole is vastgesteld, gebruik een glazen trekker om canules te maken met een fijn punt aan de ene kant, en gebruik tangen om de punt van elke canule te breken, zodat de drug van belang soepel kan stromen door de tip op vijf pond druk per vierkante inch.
Vul de canule met het medicijn van belang. En laad de canule op een drieassige micromanipulator aan de microscoop. Sluit de slang van het drukuitwerpsysteem aan op de canule en laat de canule langzaam in het bad in de buurt van de haarvaten zakken, waarbij u ervoor zorgt dat het schip of de kamer niet wordt geraakt.
Om de haarvaten te stimuleren, laat u de canule naar de coverslip net naast de haarvaten zakken en activeer het drukuitwerpsysteem met de gewenste uitwerptijd. Verhoog aan het einde van de stimulatie de canule iets om verdere stimulatie te voorkomen. Om te bevestigen dat alleen de haarvaten werden gestimuleerd, vul de nieuwe canule met één micromolar NS309-oplossing en stimuleer de haarvaten zoals aangetoond.
Verkrijg vervolgens de maximale vaatverwijding door het preparaat te baden met de calciumvrije oplossing. De toepassing van het bad van één micromolar NS309 veroorzaakt een dichtbijgelegen maximale dilatatie van arteriole toe te schrijven aan Calcium-gevoelige Kaliumkanalen in het endothhelium. Capillaire endotheelcellen echter, gebrek aan tussenliggende en kleine geleiding kanalen en niet hyperpolariseren in reactie op de agonist, als gevolg daarvan, het stimuleren van haardolelijke uiteinden met NS309, veroorzaakt geen upstream arteriolar dilatatie, dit geeft aan dat NS309 niet de arteriole bereikt, en kan worden gebruikt als een controle om toegang te krijgen tot de ruimtelijke beperking van de verbinding op toegepaste op toegepaste haarvaten door middel van druk ejection.
Met behulp van de hippocampal capillaire parenchymale arteriole voorbereiding zoals aangetoond, de toepassing van een kunstmatige hersenvocht aangevuld met 10 millimolar Kalium op de capillaire uiteinden, resulteert in een upstream arteriolar dilatatie die niet verschilt tussen preparaten van mannelijke en vrouwelijke muizen. Verder, de toevoeging van de Kir2 remmer ML 133, vrijwel schaft de capillaire geïnduceerde arteriolar dilatatie, in reactie op 10 millimolar Kalium in preparaten van zowel mannelijke als vrouwelijke muizen. Bij het monteren van de bloedsssel, beperken directe interacties met het bloedvat om de schade aan te minimaliseren, en verhoging van de levensvatbaarheid van het vat.
Zodra het bloedvat is geïsoleerd, verschillende geneesmiddelenverbindingen kunnen worden getest of het bloedvat kan verder worden verwerkt voor oleculaire biologie, immunochemie, of elektrofysiologie studies.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
