Neuroscience
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Ex Vivo 가압 해모골 모세관-Parenchymal Arteriole 기능 적 연구를 위한 준비
Chapters
Summary December 18th, 2019
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본 원고는 마우스 뇌에서 해마 동맥과 모세 혈관을 분리하는 방법과 압력 myography, 면역 형광, 생화학 및 분자 연구를 위해 그들을 가압하는 방법을 자세히 설명합니다.
Transcript
우리의 방법은 그렇지 않으면 해마와 같은 Vivo에서 이미지하기 어려울 것이다 구조에 있는 혈관의 연구를 허용합니다. 혈관은 뇌 조직에서 제거되기 때문에 모세 혈관과 동맥 사이의 신호는 주변 조직에 대한 오프 타겟 효과없이 연구 할 수 있습니다. 해마를 분리하려면 작은 해부 가위를 사용하여 마우스 머리 상단의 중간선을 따라 피부를 자르고 피부를 측면으로 이동시합니다.
두개골의 코달 측면에서 시작하여 후각 전구에 도달 할 때까지 중간선을 따라 두개골을 자르고 두개골이 노출 될 때까지 두개골의 일부를 제거하십시오. 마우스의 코 근처에서 시작하여 가위를 사용하여 후각 전구, 두개골 신경 및 척수를 잘라 내어 뇌를 천천히 제거합니다. 뇌를 침수하고, 복부 면을 MOPS 버퍼드 식염수, 해부 판의 중앙에 아래로 잠수하고, 해부 현미경 아래에 접시를 놓습니다.
접시의 바닥에 평행날카로운 가장자리를 잡고, 한 스트로크에서 세로 균열을 따라 반으로 뇌를 잘라 면도날을 사용합니다. 중간선을 향한 접시 중앙에 한 반구를 놓고 소뇌와 뇌줄기를 제거하기 위해 횡방향 균열을 따라 조직을 통해 면도날을 똑바로 밀어 넣습니다. 내측이 위쪽을 향하고 있는지 반구를 회전시키고 주걱을 사용하여 뇌를 제자리에 고정시하십시오.
코퍼스 캘로섬 아래에 두 번째 주걱 의 끝을 삽입, 해마에서 시상, 중격 및 시상 하부를 제거하기 위해 조직 아래에 특종. 해마는 이제 뇌의 후방 측면 근처의 곡선 구조로 볼 수 있어야합니다. 한 주걱을 사용하여 뇌막을 제자리에 고정시면 두 번째 주걱을 사용하여 뇌마를 자궁에서 내보냅니다.
그런 다음 해마를 새로운 해부 판으로 옮기고, 신선한 MOP 용액으로 절반 정도 채워지도록 합니다. 해마 동맥 격리를 위해, 샘플 해마 동맥 측면을 위로 확보하기 위해 한 해마의 각 끝에 작은 핀을 배치합니다. 매우 날카로운 집게를 사용하여 해마의 작은 부분을 부드럽게 스트레칭하여 동맥을 둘러싼 조직을 풀어냅니다.
그리고 외장 횡방향 동맥을 식별하기 위해 등쪽 해마 조직을 검색합니다. 동맥이 발견되면 해마에서 외부 횡단 동맥을 잡고 천천히 조직에서 당겨 동맥과 모세 혈관을 수집합니다. 각 해마의 동맥은 별도로 제거됩니다.
더 이상 제거할 혈관이 없을 때, 얼음에 샘플을 놓고 나머지 해마 조직을 폐기하십시오. 동맥의 수조를 위해, 모세 혈관으로 끝나는 가지를 찾아 내고 동맥을 장기 챔버에 놓습니다. 조심스럽게 혈관을 장착하기 위해 대상 영역 아래 의 동맥 벽을 통해 캐뉼라 팁을 밀어.
그런 다음, 조심스럽게 넥타이를 배치 할 수있는 충분한 조직이있을 때까지 캐뉼라에 혈관을 밀어. 12-0 나일론 봉합사를 사용하여 혈관과 캐뉼라에 맞는 느슨한 매듭을 만들고, 반 히치 매듭을 사용하여 넥타이를 고정하고, 끝을 당겨 매듭을 당겨 캐뉼라에 동맥을 고정하십시오. 아티리올의 다른 쪽 끝에 또 다른 넥타이를 고정하여 밀봉합니다.
챔버의 반대편에, 캐뉼라의 지점이 동맥의 끝에 넥타이 아래로 핀 때까지 두 번째 캐뉼라를 낮춥다. 그런 다음 세 번째 캐뉼라를 사용하여 모세 혈관 가지를 표지 슬립에 고정하고 팁을 분기 의 끝 부분에 가깝게 두면서 모세 혈관의 끝이 노출됩니다. 뇌 미세 순환이 정교하게 깨지기 때문에, 동맥의 생존을 보장하기 위해 캐니레이션 절차 동안 혈관의 스트레칭과 처리를 최소화해야합니다.
압력 myography 분석을 위해, 기록 소프트웨어와 함께 가벼운 현미경 단계로 챔버를 전송하고 풍부하기 위해 챔버에 유입 및 유출 튜브를 연결합니다. 분당 4밀리리터의 인공 뇌척수액37도로 증식을 시작하고 압력 트랜스듀서와 페어링된 연동 펌프에 가압 캐뉼라를 부착합니다. 내부 압력을 20밀리미터의 머큐리로 가져와 녹음 소프트웨어를 시작하십시오.
현미경과 이미지 설정을 조정하여 가능한 가장 선명한 이미지를 구현합니다. 그리고 에지 검출 소프트웨어를 사용하여 동맥이 완전히 팽창될 때 직경이 약 15~30 마이크로미터인지 확인합니다. 설정이 최적화되면 레코딩을 시작하고 선박의 내혈관 압력을 최대 40mm까지 늘리는 동시에 에지 감지 소프트웨어로 동맥 직경을 기록합니다.
그런 다음 15~20분 동안 챔버를 사용하여 MOP 용액을 씻어낸다. 선박의 생존 가능성을 테스트하려면, 목욕 풍부에 하나의 마이크로 몰러 NS309 용액을 적용, 동맥 세그먼트는 30 ~ 40 %의 근생 톤을 시연, 팽창한다. 동맥의 기준선 톤이 확립되면 유리 풀러를 사용하여 한쪽 끝에 미세한 포인트로 캐뉼라를 만들고 집게를 사용하여 각 캐뉼라의 끝을 깨뜨려 관심있는 약물이 평방 인치 당 5 파운드의 압력으로 끝을 통해 원활하게 흐를 수 있습니다.
관심의 약물캐뉼라를 채웁니다. 그리고 현미경에 부착 된 3 축 미세 조작기에 캐뉼라를로드합니다. 압력 배출 시스템에서 캐뉼라에 튜브를 연결하고, 혈관이나 챔버의 일부를 치지 않도록 주의하여 카누라를 모세혈관 근처의 욕조로 천천히 낮춥니다.
모세 혈관을 자극하기 위해, 모세 혈관 바로 옆에 있는 커버슬립으로 캐뉼라를 낮추고 원하는 배출 시간으로 압력 배출 시스템을 활성화한다. 자극의 끝에서, 추가 자극을 피하기 위해 약간 캐뉼라를 올립니다. 모세혈관만 자극되고 있음을 확인하려면 새로운 캐뉼라를 NS309 용액의 1마이크로몰라로 채우고 모세혈관을 자극합니다.
그런 다음 칼슘이 없는 용액으로 준비하여 최대 혈관 확장을 얻습니다. 1개의 마이크로몰러 NS309의 목욕 응용은 내피의 칼슘 에 민감한 칼륨 채널로 인해 동맥의 거의 최대 팽창을 일으킵니다. 모세관 내피 세포는 그러나 중간 및 소형 전도성 채널이 부족하고 고뇌에 대한 응답으로 과극화하지 않으며, 그 결과, 모세관을 NS309로 자극하고, 상류 동맥 팽창을 일으키지 않으며, 이는 NS309가 동맥에 도달하지 못했고, 이는 포세피라압력에 대한 접근조절으로 사용될 수 있음을 나타낸다.
입증된 바와 같이 해마 모세관 당면 성동맥 제제를 사용하여, 모세관 끝에 10 밀리머 칼륨으로 보충된 인공 뇌척수액의 적용은 남성과 여성 마우스의 제제마다 다르지 않은 상류 동맥 팽창을 초래한다. 또한, Kir2 억제제 ML 133의 첨가는, 모세관 유도 된 동맥 팽창을 사실상 폐지하며, 남성과 여성 마우스 모두에서 준비시 10 밀리머 칼륨에 대응한다. 혈액 베셀을 장착할 때 혈관과의 직접적인 상호 작용을 제한하여 손상을 최소화하고 혈관의 생존 가능성을 높입니다.
일단 혈관이 고립되면, 다른 약 화합물을 시험할 수 있고 혈관은 전골 생물학, 면역화학, 또는 전기생리학 연구를 위해 추가처리될 수 있다.
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