Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Ex vivo trycksatt Hippocampus kapillär-parenkymal arteriole förberedelse för funktionell studie
Chapters
Summary December 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den nuvarande manuskript Detaljer hur man isolerar Hippocampus arterioler och kapillärer från mus hjärnan och hur man pressar dem för tryck myography, immunofluorescenser, biokemi, och molekylära studier.
Transcript
Vår metod möjliggör studier av blodkärl som ligger i strukturer som annars skulle vara svåra att avbilda i Vivo, såsom hippocampus. Eftersom blodkärlen avlägsnas från hjärnvävnaden, signalering mellan kapillärerna och arteriole kan studeras utan off-target effekter på den omgivande vävnaden. För att isolera hippocampus, använd små dissection saxar för att skära huden längs mittlinjen på toppen av huvudet på musen och flytta huden åt sidorna.
Med början vid skallens kaudala sida, skär skallen längs mittlinjen tills luktglödlamporna har nåtts och ta bort delar av skallen tills storhjärnan är utsatt. Börjar nära näsan på musen, långsamt bort hjärnan, med hjälp av saxen för att skära igenom luktlökar, kranialnerv och ryggmärg. Submerge hjärnan, ventrala sidan ner i MOPS Buffrad Koksalt, i mitten av en dissekering platta, och placera plattan under en dissekering mikroskop.
Hålla den skarpa kanten parallellt med botten av skålen, använd rakblad för att skära hjärnan på mitten längsgående spricka i ett slag. Placera en halvklot i mitten av plattan med mittlinjen vänd nedåt och tryck rakbladet rakt genom vävnaden längs tvärgående spricka för att avlägsna lillhjärnan och hjärnstammen. Rotera halvklotet så att den mediala sidan är vänd uppåt och använd en spatel för att hålla hjärnan på plats.
Sätt in spetsen på en andra spatel under corpus callosum, ösa under vävnaden för att ta bort thalamus, septum, och hypotalamus från hippocampus. Hippocampus bör nu vara synlig som en böjd struktur nära den bakre sidan av storhjärnan. Använd en spatel för att hålla storhjärnan på plats, använd den andra spatel för att skopa hippocampus ur storhjärnan.
Överför sedan hippocampi till en ny dissektionsplatta, fylld ungefär halvvägs med färsk MOP-lösning. För hippocampus arteriole isolering, placera små stift i varje ände av en hippocampus för att säkra provet hippocampus artär sidan upp. Använda mycket skarpa tänjningar, försiktigt sträcka små delar av hippocampi att lossa vävnaden som omger arterioler.
Och sök igenom dorsala hippocampus vävnader för att identifiera de yttre tvärgående artärerna. När artären har lokaliserats, ta tag i den yttre tvärgående artären från hippocampus och långsamt dra bort den från vävnaden för att samla in arterioler och kapillärer. Artären från varje hippocampus avlägsnas separat.
När det inte finns några fler fartyg som ska tas bort, placera proverna på is och kasta den återstående hippocampus vävnaden. För kanylulation av arterioler, lokalisera och arteriole med en gren som slutar med kapillärer och placera arteriole i en orgel kammare. Tryck försiktigt kanylspetsen genom arterioleväggen nedanför målområdet för att montera blodkärlet.
Sedan försiktigt glida fartyget på kanylen tills det finns tillräckligt med vävnad som att placera slips. Använd 12-0 nylon suturer för att göra en lös knut som kommer att passa över blodkärlet och kanylen, och använda en halv hitch knut för att säkra banden, dra ändarna för att dra åt knuten för att säkra arteriole till kanylen. Säkra en annan slips på andra änden av arteriole att täta den.
På motsatt sida av kammaren, sänk en andra kanyl tills kanylens punkt stift ner slipsen på arteriolens ände. Använd sedan en tredje kanyl för att fästa kapillärgrenen på täckplattan, placera spetsen nära slutet av grenen, samtidigt som ändarna på kapillärerna exponeras. Som hjärnans mikrocirkulation är utsökt bräcklig, se till att minimera sträckning och hantering av kärlen under cannulation förfarandet för att säkerställa överlevnad av arterioler.
För tryck myografi analys, överföra kammaren till ett ljus mikroskop skede med inspelning programvara och ansluta inflöde och utflöde slangar till kammaren för profusion. Starta profusion med 37 grader Celsius Konstgjord cerebrospinalvätska vid en fyra milliliter per minut flödeshastighet, och fäst den pressande kanylen till peristaltisk pump i kombination med en tryckgivare. Ta med det inre trycket till 20 millimeter Merkurius och starta inspelningsprogramvaran.
Justera mikroskopet och bildinställningarna för att uppnå en så tydliga bild som möjligt. Och använda Edge Detection programvara för att kontrollera att arteriole är ca 15 till 30 mikrometer i diameter när den är helt vidgade. När inställningarna har optimerats, påbörja inspelningen och öka det intravaskulära trycket i kärlet upp till 40 millimeter Mercury, samtidigt som du spelar in arteriole diameter med Edge Detection-programvaran.
Sedan ymnig kammaren i 15 till 20 minuter för att tvätta ur MOP-lösningen. För att testa livskraften hos kärlet, applicera en mikromolar NS309 lösning på badet profusion, bör arteriolar segmentet vidgas, visar en 30 till 40%myogenic ton. När baslinjen tonen för arteriole har fastställts, använd en glas puller att göra kanylerna med en fin punkt i ena änden, och använda forceps för att bryta spetsen på varje kanyl, så att läkemedlet av intresse kan flöda smidigt genom spetsen på fem pounds av tryck per kvadrattum.
Fyll kanylen med drogen av intresse. Och ladda kanylen på en treaxlad mikromanipulator fäst vid mikroskopet. Anslut slangen från tryckutskjutningssystemet till kanylen, och sänk långsamt ner kanylen i badet nära kapillärerna, var noga med att inte träffa någon del av kärlet eller kammaren.
För att stimulera kapillärerna, sänk kanylen till täckbladet precis intill kapillärerna och aktivera tryckutskjutningssystemet med önskad utskjutningstid. Vid slutet av stimuleringen höjer du kanylen något för att undvika ytterligare stimulering. För att bekräfta att endast kapillärerna stimulerades, fyll den nya kanylen med en mikromolekyl av NS309-lösning och stimulera kapillärerna som visats.
Erhåll därefter maximalen vasodilation, genom att bada förberedelsen med Den Calcium-fria lösningen. Badapplikation av en en micromolar NS309 orsakar en nära maximal dilation av arteriolen tack vare det Calcium-känsliga Potassium kanaliserar i endotheliumet. Kapillär endotelceller dock saknar mellanliggande och små ledningskanaler och inte hyperpolarisera inte som svar på agonisten, som ett resultat, stimulerande kapillär slutar med NS309, inte orsakar uppströms arteriolar dilation, detta indikerar att NS309 inte nådde arteriole, och kan användas som en kontroll för att komma åt spacial begränsning av föreningen tillämpas på kapillärer av tryckutskjutning.
Använda hippocampus kapillär parenchymal arteriole preparatet som visats, tillämpningen av en Artificiell cerebrospinalvätska kompletteras med 10 millimolar Kalium till kapillärändarna, resulterar i en uppströms arteriolar dilation som inte skiljer sig mellan preparat från manliga och kvinnliga möss. Vidare, tillsats av Kir2-hämmare ML 133, praktiskt taget avskaffar kapillärinducerade arteriolar dilation, som svar på 10 millimolar Kalium i preparat från både manliga och kvinnliga möss. Vid montering av blodet vesssel, begränsa direkta interaktioner med blodkärlet för att minimera skadan på, och öka livskraften hos kärlet.
När blodkärlet har isolerats, olika läkemedelsföreningar kan testas eller blodkärlet kan bearbetas ytterligare för olecular biologi, immunokemi, eller elektrofysiologi studier.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
