Biochemistry
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哺乳动物组织和异种卵母细胞与胆固醇的丰富
Chapters
Summary March 25th, 2020
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提出了两种胆固醇富集方法：应用富含胆固醇的环糊精来丰富哺乳动物组织和细胞，以及利用富含胆固醇的磷脂型分散物（脂质体）来丰富Xenopus卵母细胞。这些方法有助于确定胆固醇水平升高对分子、细胞和器官功能的影响。
Transcript
胆固醇升高是心血管和神经退行性疾病的主要危险因素。我们的协议为研究高胆固醇血症的生理和机械后果提供了宝贵的工具。这些程序可以使用基本的实验室设备执行，并适用于细胞、组织和异形细胞。
胆固醇是全身细胞膜的主要成分。这些技术可用于研究任何细胞类型中胆固醇水平升高的影响。解剖动脉是最难的一步。
小心地从大脑中切除动脉，不要拉伸或损坏血管组织。脂质是非常微妙的，与他们合作更多的是一门艺术，而不是一门科学。视频演示提供了一个指南，用于学习如何小心处理脂质。
要准备胆固醇饱和甲基-β-环糊精溶液，首先将064克甲基-β-环糊精加入10毫升PBS，用搅拌棒搅拌溶液，确保甲基-β-环糊精完全溶解。接下来，在烧瓶中加入0024克胆固醇粉，用铲子搅拌溶液，以分解尽可能多的胆固醇块。当几乎所有的胆固醇都溶解后，用至少两层石蜡膜密封烧瓶。
在37摄氏度的水浴中，每分钟摇动约30次振荡的烧瓶。8至16小时后，将溶液冷却至室温，然后通过22微米聚氨酯纤维素注射器过滤器将混合物过滤到一类瓶中。对于哺乳动物脑动脉富集，将大脑从250克至300克Sprague Dawley大鼠收获到冰上PBS的烧杯中，然后将大脑转移到一个打蜡的解剖碗中，在解剖显微镜下，含有足够的PBS，使组织陷入水。
用两到三个针针固定大脑，确保它们不会穿透血管。并使用锋利的钳子和小手术剪刀轻轻地解剖脑动脉及其分支，形成大脑底部的威利斯圈。接下来，在PBS中短暂冲洗长达一厘米的动脉段，然后用足够的胆固醇富集将冲洗过的动脉段孵育，以覆盖组织。
要确定胆固醇水平的任何变化，使用一瓶新鲜的菲利平粉，以二甲基硫化物的染料每毫升10毫克的库存溶液，用三个五分钟的新鲜PBS洗涤胆固醇丰富的组织。上次洗涤后，将动脉段在 4%对甲醛中固定 15 分钟，在防光下，在 PBS 中 5%Triton 中渗透样品 10 分钟。在孵化结束时，在摇床上用PBS洗涤三个五分钟，然后将样品加入每毫升25微克的菲利平染料溶液最终浓度25微克，在室温下洗涤一小时，防止光线。
在孵化结束时，按照演示，将动脉片洗三次，然后用蒸馏水短暂冲洗。最后一次洗涤后，使用实验室组织吸收任何多余的液体，并使用适当的安装介质将动脉安装到幻灯片上。小心地用盖滑盖住动脉，注意避免组织滚动或扭曲，让滑轨在室温下干燥24小时，防止光线。
当安装介质干燥时，用透明指甲油密封盖滑边，让抛光剂干燥 10 至 15 分钟。然后，用340至380纳米的激发和385至470纳米的发射图像组织。为了准备基于磷脂的分散，将200微升每毫升10毫克氯仿溶解脂质溶液、L-α-磷脂乙醇胺、1-棕榈-2-奥莱霉素-糖-3磷管和胆固醇在12毫升玻璃管中。
在氮流下蒸发机罩中的氯仿，然后悬浮在缓冲的 150 毫摩尔氯化钾和 10 毫摩尔 Tris HEPES 溶液的 800 微升中悬浮脂质。然后用石蜡膜密封管，以80千赫轻轻声波化管内色10分钟，直到形成乳白色混合物。对于富含Xenopus卵母细胞的胆固醇，使用锋利的钳子在多个区域破坏雌性Xenopus laevis青蛙的卵巢囊，将卵巢块放入60毫米的盘子里，其中5毫升不含钙ND96，每毫升胶原蛋白补充5毫克。
在室温下以每分钟 60 次振荡摇动轨道摇床上的组织 15 分钟。在孵育结束时，使用具有宽尖端的转移移液器，大力移液含有溶液的卵母细胞，以分离单个卵母细胞，并用新鲜无钙ND96快速冲洗暗卵母细胞溶液，直到溶液变得透明。接下来，将90微升的胆固醇富磷脂为基础的分散物转移到96井板的一个井中，并用尽可能少的介质将6个卵母细胞加到井中。
将 96 井板放在三维平台旋转器上 5 到 10 分钟。然后向井中加入一滴ND96，并将富含胆固醇的卵母细胞转移到含有ND96的35毫米板中，供其立即分析。在这里，一个图像脑动脉平滑肌肉层的例子表明，在组织富集上获得的脂肪相关荧光的浓度依赖性增加与胆固醇浓度的增加有关。
值得注意的是，在甲基-β-环糊精胆固醇复合物治疗后三个小时，胆固醇水平比浓缩后立即降低约50%。虽然一个小时的孵育时间通常用于丰富组织和细胞与胆固醇在这种方法，5分钟的孵化通常足以实现统计显著增加脑动脉胆固醇含量由胆固醇氧化酶为基础的生化测定。虽然 Xenopus 卵母细胞的胆固醇水平没有显著变化，但缺乏胆固醇的基于控制磷脂的分散体，在治疗仅五分钟后，胆固醇水平就显著增加，而包括胆固醇的磷脂为基础的分散体，当孵化时间增加到 60 分钟时，胆固醇水平会显著升高。
从海马体的CA1区域新鲜分离的神经元中也证明了基于环糊精的富细胞方法的有效性。事实上，在含有胆固醇的甲基-β-环糊精中孵育神经元60分钟，使胆固醇水平增加两倍以上，如菲律宾相关荧光评估。总的来说，这些程序的两个最重要的步骤是准备胆固醇富集混合物和确保动脉组织的完整性。
在胆固醇富集之后，可以研究受高胆固醇血症影响的蛋白质的功能。富含胆固醇细胞的能力有助于研究心肌细胞和神经元中胆固醇水平升高。卵母细胞的使用使我们能够研究胆固醇如何与离子通道结合。
一件实验室外套和手套，她总是为这个协议穿。氯仿和甲醛应在烟罩下使用，并丢弃为危险废物。
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