Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Langtrækkende Channelrhodopsin-assisteret Circuit Kortlægning af ringere Colliculus Neuroner med blå og rød-flyttet Channelrhodopsins
Chapters
Summary February 7th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Channelrhodopsin-assisteret kredsløb kortlægning (CRACM) er en præcision teknik til funktionel kortlægning af langtrækkende neuronal fremskrivninger mellem anatomisk og / eller genetisk identificerede grupper af neuroner. Her beskriver vi, hvordan du udnytter CRACM til at kortlægge auditive hjernestammen forbindelser, herunder brugen af en rød-flyttet opsin, ChrimsonR.
Transcript
Channelrhodopsin-assisteret kredsløb kortlægning er en præcision teknik til funktionel kortlægning af langtrækkende neurale fremskrivninger. Her viser vi, hvordan vi bruger denne tilgang til at undersøge kredsløb i den auditive hjernestamme. I hjerne skiver, axoner fra flere kilder er ofte blandet, hvilket gør det vanskeligt at isolere individuelle indgange ved hjælp af elektrisk stimulation.
Ved at bruge CRACM, kan denne begrænsning overvindes. Finde lambda og konsekvent definere stereotaxic koordinatsystem er udfordrende, som er at holde varigheden af proceduren kort. Under alle trin omhyggeligt kortlagt vil øge din succesrate.
Begynd med at sprøjte kirurgi området med 70% ethanol til at desinfærere og placere sterile håndklæde gardiner til at dække kirurgi området. Fjern bur strøelse for at begrænse risikoen for kvælning fra genvindingsburet. Dernæst sætte en varmepude under buret og give en mad og vandkilde.
Dernæst overføre dyret til en stereotaxic ramme og fortsætte anæstesi. Sæt en rektal temperatursonde i, og tænd for den hjemmepotiske temperaturregulator. Derefter anvende oftalmologiske salve for at forhindre øjnene i at tørre ud.
Administrere forebyggende smertestillende. Endelig barber hovedbunden med elektriske klippere. Desinficere hovedbunden med tre vekslende svaberprøver af povidone jod og 70% ethanol.
Begynd kirurgi ved at gøre et snit i hovedbunden langs midterlinjen, der starter mellem ørerne og fortsætter rostral til øjnene, udsætter lambda og bregma suturer. Skub huden til siden og fjern periosteum fra den eksponerede knogle, hvis det er nødvendigt. Marker derefter lambda suturen med en kirurgisk markør, placer spidsen af nanoinjektoren, så den bare rører lambda og nulstiller mikromanipulatorkoordinaterne.
Brug nanoinjektorspidsen og mikromanipulatoren til at måle forskellen i højde mellem lambda- og bregma-suturerne. Juster paletbarhøjden for at bringe lambda og bregma inden for plus eller minus 100 mikrometerhøjdeforskel. Kort over injektionsstedet ved hjælp af nanoinjektorspidsen og mikromanipulatorkoordinatorsystemet, og marker stedet med en kirurgisk markør.
Brug derefter en mikromotorisk boremaskine med en 0,5 millimeter boretren til at udføre en kraniotomi over injektionsstedet. For at sikre bred transinfektion af neuroner i målkernen, bruge en nano-injektor til at foretage injektioner på forskellige dybder i vævet og i tilfælde af større hjerneregioner, ligesom ringere colliculus, gøre injektioner i løbet af to eller flere gennemføringer på forskellige X og Y koordinater. For at injicere de ringere colliculus, deponere 20 nanoliters af virus i intervallerne på 250 mikrometer langs Z aksen mellem 2, 250 mikrometer og 1, 750 mikrometer dybde.
Ved injektioner i den dorsale cochlearkerne aflejrer 20 nanoliters virus i en dybde på henholdsvis 4, 750 mikrometer og 4.550 mikrometer. Efter injektion ved hver Z-koordinat skal du vente to til tre minutter, før injektoren flyttes til den næste Z-koordinat for at give virusset tid til at sprede sig væk fra injektionsstedet, hvilket reducerer sandsynligheden for, at virus vil blive suget op i injektionskanalen, når nanoinjektoren flyttes. Derefter, efter den sidste injektion, vente tre til fem minutter før tilbagetrækning nano-injektor fra hjernen.
Når nanoinjektoren fjernes fra hjernen mellem gennemføringer og mellem dyr, skubbes en lille mængde virus ud af spidsen for at kontrollere, at spidsen ikke er tilstoppet. Efter injektioner, bruge sterile PBS at våd de afskårne kanter af hovedbunden og derefter forsigtigt flytte huden tilbage mod midterlinjen. Luk såret med simple afbrudte suturer ved hjælp af 6-0 nylon suturer.
Derefter anvendes 0,5 til en milliliter 2% lidocain gelé til såret. Fjern ørestængerne og temperatursonden, isofluranens drejning, og fjern dyret fra palettens bar, og overfør det til genfindingsburet. Endelig overvåge inddrivelse nøje.
Når dyret er helt vågen, bevæger sig rundt, og viser ingen tegn på smerte eller angst, overføre det tilbage i sit bur og returnere buret til vivarium. Brug standard patch clamp metoder til at lave optagelser. Begynd med at placere skiven i et optagelseskammer under et fast trin opretstående mikroskop og kontinuerligt kraftig med kunstig cerebrospinalvæske på to milliliter i minuttet.
Dernæst patch neuroner under visuel kontrol ved hjælp af en passende patch klemme forstærker. Endelig aktiveres Chronos under engrosoptagelser ved at levere korte impulser på 470 nanometerlys eller ChrimsonR med korte impulser på 580 nanometerlys gennem kommercielt tilgængelige lysdioder. Resultaterne viste, at ChrimsonR injektion førte til stærke udtryk i DCN med tdTomato fluorescens synlig i celler og fibre.
I den kontralaterale ICC, fibre stærkt mærket med tdTomato var klart synlige efter tre uger, viser langtrækkende menneskehandel evne ChrimsonR-tdTomato konstruere, når injiceres i auditive hjernestammekerner. Optisk aktivering af ChrimsonR elicted EPSPs i IC VIP neuroner, hvilket indikerer, at ChrimsonR er et nyttigt værktøj til langtrækkende CRACM eksperimenter, når de eksperimentelle parametre kræver brug af rødt lys i stedet for blåt lys. Men vi fandt, at ChrimsonR var let aktiveret med blåt lys, viser den samme tærskel for blåt lys aktivering som Chronos.
For denne protokol er det vigtigst at sikre, at stereotaxic koordinater er korrekte, og at bekræfte, at virus blev udtrykt kun i din målrettede hjerne region. Ved at udveksle Chronos ChrimsonR viroconstruct med en anden virus, for eksempel en celle specifik Flex virus, kan du besvare flere anatomiske eller fysiologiske spørgsmål uden at ændre kirurgi protokol.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
