Channelrhodopsin-assisteret kredsløb kortlægning (CRACM) er en præcision teknik til funktionel kortlægning af langtrækkende neuronal fremskrivninger mellem anatomisk og / eller genetisk identificerede grupper af neuroner. Her beskriver vi, hvordan du udnytter CRACM til at kortlægge auditive hjernestammen forbindelser, herunder brugen af en rød-flyttet opsin, ChrimsonR.
Når man undersøger neurale kredsløb, en standard begrænsning af in vitro patch klemme tilgang er, at axoner fra flere kilder er ofte blandet, hvilket gør det vanskeligt at isolere input fra individuelle kilder med elektrisk stimulation. Men ved hjælp af channelrhodopsin assisteret kredsløb kortlægning (CRACM), kan denne begrænsning nu overvindes. Her rapporterer vi en metode til at bruge CRACM til at kortlægge stigende input fra lavere auditive hjernestammen kerner og commissural input til en identificeret klasse af neuroner i ringere colliculus (IC), midthjernen kernen i det auditive system. I IC, lokale, commissural, stigende, og faldende axoner er stærkt sammenflettet og derfor umulig at skelne med elektrisk stimulation. Ved at injicere en viral konstruktion til at drive udtryk for en kanalrhodopsin i en presynaptic kerne, efterfulgt af patch clamp optagelse til at karakterisere tilstedeværelsen og fysiologi en kanalrhodopsin-udtrykke synaptiske indgange, fremskrivninger fra en bestemt kilde til en bestemt population af IC-neuroner kan kortlægges med celletypespecifik nøjagtighed. Vi viser, at denne tilgang virker med både Chronos, en blå lyse-aktiveret channelrhodopsin, og ChrimsonR, en rød-flyttet kanalrhodopsin. I modsætning til tidligere rapporter fra forhjernen, finder vi, at ChrimsonR er robust smuglet ned axoner af rygsamarbejde cochlear kerne vigtigste neuroner, hvilket indikerer, at ChrimsonR kan være et nyttigt redskab til CRACM eksperimenter i hjernestammen. Protokollen præsenteres her indeholder detaljerede beskrivelser af intrakraniel virus injektion kirurgi, herunder stereotaxic koordinater for målretning injektioner til rygsamarbejde cochlear kernen og IC af mus, og hvordan man kombinerer hele celle patch clamp optagelse med channelrhodopsin aktivering for at undersøge langtrækkende fremskrivninger til IC neuroner. Selv om denne protokol er skræddersyet til at karakterisere auditive input til IC, kan den nemt tilpasses til at undersøge andre langtrækkende fremskrivninger i den auditive hjernestammen og videre.
Synaptiske forbindelser er afgørende for neurale kredsløb funktion, men den præcise topologi og fysiologi af synapser i neurale kredsløb er ofte vanskelige at sonde eksperimentelt. Dette skyldes, at elektrisk stimulation, det traditionelle værktøj af cellulær elektrofysiologi, vilkårligt aktiverer axoner nær stimulering sstedet, og i de fleste hjerneregioner, axoner fra forskellige kilder (lokale, stigende, og / eller faldende) intertwine. Ved hjælp af channelrhodopsin assisteret kredsløb kortlægning (CRACM)1,2, denne begrænsning kan nu overvindes3. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktiveret, kation-selektiv ion kanal oprindeligt findes i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres ved blåt lys af en bølgelængde omkring 450-490 nm, depolariserende cellen gennem kation tilstrømning. ChR2 blev først beskrevet og udtrykt i Xenopus oocytes af Nagel og kolleger4. Kort tid efter udtrykte Boyden og kolleger5 ChR2 i pattedyrneuroner og viste, at de kunne bruge lysimpulser til pålideligt at styre spiking på en millisekund tidsskala, inducerende virkningpotentialer ~ 10 ms efter aktivering af ChR2 med blåt lys. Optogenetiske kanaler med endnu hurtigere kinetik er blevet fundet for nylig (f.eks Chronos6).
Den grundlæggende tilgang til en CRACM eksperiment er at transfect en befolkning af formodede presynaptic neuroner med en rekombinant adeno-associeret virus (rAAV), der bærer den genetiske information til en kanalrhodopsin. Transfection af neuroner med rAAV fører til udtryk for den kodede channelrhodopsin. Typisk er kanalrhodopsin mærket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescerende Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), således at transfection af neuroner i målregionen nemt kan bekræftes med fluorescensbilleddannelse. Fordi rAV’er er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potentiale og langvarig genekspression7,8, er de blevet en standard teknik til at levere kanalrhodopsins til neuroner. Hvis aktivering af en kanalrhodopsin gennem lysblinker efter transfection af en formodet presynaptisk population af neuroner fremkalder postsynaptiske potentialer eller strømme i målneuronerne, hvilket er tegn på en axonal forbindelse fra den transfunderede kerne til den registrerede celle. Fordi afhuggede axoner i hjernen skive eksperimenter kan køres til at frigive neurotransmitter gennem channelrhodopsin aktivering, kerner, der ligger uden for den akutte skive, men sende axoner ind i postsynaptiske hjerne regionen kan identificeres med CRACM. Kraften i denne teknik er, at tilslutning og fysiologi af identificerede langtrækkende synaptiske input kan undersøges direkte.
Ud over kanalrhodopsins, der er excitable af blåt lys, efterforskere har for nylig identificeret flere rød-flyttet channelrhodopsins9,10, herunder Chrimson og dens hurtigere analogChrimsonR, som begge er begejstrede med rødt lys på ~ 660 nm6. Rød-skiftede opsins er af interesse, fordi rødt lys trænger væv bedre end blåt lys, og rødt lys kan have en lavere cytotoksicitet end blåt lys10,11,12. Rød-flyttet channelrhodopsins også åbne mulighed for dobbelt farve CRACM eksperimenter, hvor konvergensen af axoner fra forskellige kerner på samme neuron kan testes i et eksperiment6,13,14. Men, nuværende rød-skiftede opsins ofte udviser uønsket krydsaktivering med blåt lys15,16,17, hvilket gør to farveeksperimenter vanskelig. Desuden har nogle rapporter vist, at ChrimsonR gennemgår begrænset axonal handel, hvilket kan gøre det udfordrende at bruge ChrimsonR til CRACM eksperimenter16,17.
Næsten alle stigende fremskrivninger fra den lavere auditive hjernestammen kerner konvergerer i ringere colliculus (IC), midthjernen hub af den centrale auditive vej. Dette omfatter fremskrivninger fra cochlear kernen (CN)18,19, det meste af det overlegne olivary kompleks (SOC)20, og ryg (DNLL) og ventral (VNLL) kerner af den laterale lemniscus21. Derudover en stor faldende fremskrivning fra den auditive cortex ophører i IC18,19,20,21,22, og IC neuroner selv synapse bredt inden for de lokale og kontralaterale lapper af IC23. Sammenblanding af axoner fra mange kilder har gjort det vanskeligt at sonde IC kredsløb ved hjælp af elektrisk stimulation24. Som et resultat, selv om neuroner i IC udføre beregninger vigtigt for lyd lokalisering og identifikation af tale og anden kommunikation lyde25,26, organiseringen af neurale kredsløb i IC er stort set ukendt. Vi har for nylig identificeret VIP neuroner som den første molekylært identificerbare neuron klasse i IC27. VIP neuroner er glutamatergic stellate neuroner, der projektet til flere langtrækkende mål, herunder auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nu i stand til at bestemme kilderne til og funktionen af lokale og langtrækkende input til VIP neuroner og til at bestemme, hvordan disse kredsløb forbindelser bidrager til lydbehandling.
Protokollen præsenteres her er skræddersyet til at undersøge synaptiske input til VIP neuroner i IC af mus, specielt fra den kontralaterale IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan nemt tilpasses forskellige kilder til input, en anden neuron type eller en anden hjerne region helt. Vi viser også, at ChrimsonR er en effektiv rød-flyttet kanalrhodopsin for langtrækkende kredsløb kortlægning i auditive hjernestammen. Men vi viser, at ChrimsonR er stærkt aktiveret af blåt lys, selv ved lave intensiteter, og dermed, at kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farve CRACM eksperimenter, omhyggeligkontrol skal bruges til at forhindre krydsaktivering af ChrimsonR.
Vi har konstateret, at CRACM er en kraftfuld teknik til at identificere og karakterisere langtrækkende synaptiske input til neuroner i musen IC. Efter den protokol, der er beskrevet her, opnåede vi robust transfection af neuroner i DCN og IC samt pålidelig axonal handel med Chronos og ChrimsonR til synaptiske terminaler i IC. Derudover viste vi, at denne teknik muliggør måling og analyse af postsynaptiske hændelser, herunder PSP amplitude, halvbredde, henfaldstid og receptorfarmakologi. Vores erfaring tyder på, at…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et Deutsche Forschungsgemeinschaft Research Fellowship (GO 3060/1-1, projektnummer 401540516, til GD) og National Institutes of Health grant R56 DC016880 (MTR).
AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
Fixed stage microscope | any | n/a | |
Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
Heating pad | Custom build | N/A | |
Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
Standard chemicals | local vendors | N/A | |
standard imaging solutions | |||
Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
Temperature controller | Custom build | N/A | |
Vibratome | any | n/a | |
VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
Water bath | any | n/a |