Arricchimento simultaneo dell'affinità di due modifiche post-traduzionali per la quantificazione e la localizzazione del sito

Questo protocollo descrive la nuova tecnica per l’arricchimento simultaneo di più PTM con anticorpi seguita dall’analisi della spettrometria di massa di acquisizione indipendente dai dati per ottenere informazioni biologiche sulla localizzazione del sito e sul cross-talk. Si tratta di una tecnica efficace in termini di tempo e costi che consente l’identificazione simultanea e la quantificazione dei peptidi con affettamento contenente PTM di acetilazione e concisilazione con solo piccole quantità di input del campione. Il monitoraggio delle modifiche post-tras traslazione è un passo importante nella caratterizzazione e nella lotta contro i diversi stati delle malattie.

Siamo già consapevoli che alcuni tumori e diabete sono altamente regolamentati attraverso queste modifiche proteiche. Questo metodo può teoricamente applicarsi a qualsiasi PTM con anticorpi per l’arricchimento come ubiquitinazione, fosforilazione e altri. Può anche applicarsi ad altri tipi di tessuto o modelli di coltura cellulare.

La chiave per ottenere dati preziosi utilizzando questa tecnica è la riproducibilità. Questo può essere ottenuto assicurando che tutte le fasi siano eseguite con molta attenzione, in particolare le fasi che coinvolgono le perline anticorpali. Per iniziare, ottenere cartucce contenenti resina C18 che combinava fino a 10 milligrammi di proteine.

Inserire queste cartucce in un apparato sottovuoto. Aggiungere 800 microlitridi di acetonitrile all’80% e allo 0,2% di acido formico alle cartucce con il 19,8% di acqua e iniziare l’aspirazione sottovuoto per far passare il liquido. Ripetere questo passaggio una volta evitando completamente l’asciugatura delle cartucce.

Equilibrare le cartucce aggiungendo 800 microlitri di acido formico allo 0,2% in acqua con aspirazione sottovuoto. Ripeti questo due volte. Caricare peptidi da un milligrammo in circa 1.000 microlitri sulle cartucce con aspirazione sottovuoto.

Lavare i peptidi due volte con 800 microlitri dello 0,2% di acido formico in acqua sotto aspirazione sotto vuoto. Quindi disporre tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri sotto ogni cartuccia per raccogliere il peptide. Sotto aspirazione sottovuoto, elute peptidi da cartucce prima con 800 microlitridi dell’80% acetonitrile e 0,2% di acido formico nel 19,8% di acqua e poi con 400 microlitri della stessa soluzione.

Asciugare completamente i campioni di peptide dissale in un concentratore sottovuoto per due o tre ore. Ora, rimospendare i peptidi essiccati in 1,4 millilitri di tampone di purificazione dell’immunoaffinità 1X fredda. Vortice per mescolare e garantire un pH di circa 7.

Centrifugare i campioni a 10.000 volte g per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Appare un piccolo pellet. Mettere da parte i peptidi sul ghiaccio mentre si preparano le perline anticorpali.

Aggiungere un millilitro di PBS freddo 1X a un tubo contenente 100 microlitri di liquame di perline anticorpali K-acetil e un tubo contenente 100 microlitri di liquami di perline anticorpali K-succinili e mescolare mediante pipettazione. Trasferire l’intera soluzione in nuovi tubi da 1,5 millilitri e ruotare in una centrifuga in miniatura per 30 secondi a temperatura ambiente. Aspirare il PBS facendo attenzione a evitare di aspirare eventuali perline.

Ripetere il lavaggio altre tre volte. Successivamente, rimospendare le perline in circa 440 microlitri di PBS. Pipettare le perline più volte per mescolare bene.

Con 200 punte di pretaglio di microlitri, trasferire 100 microlitri di ogni perline anticorpali di acetillysina e perline anticorpali succinillysina in un nuovo tubo. Spingi verso il basso per 30 secondi in una centrifuga in miniatura e aspira il supporto con una punta del caricatore di gel. Le perline ora diventano bianche.

Pipettare il peptide rimorsidito direttamente sulle perline lavate e incubare i peptidi con perline a quattro gradi Celsius durante la notte con agitazione. Al mattino, ruotare i campioni di peptide a 2.000 volte g per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Rimuovere il supernatante contenente peptidi non abbondanti e salvare per esperimenti futuri, se lo si desidera.

Aggiungere un millilitro di tampone di purificazione immunoaffinità 1X freddo alle perline da lavare e mescolare invertendo cinque volte. Gira a 2.000 volte g per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Aspirare la soluzione di purificazione dell’immunoaffinità e ripetere ancora una volta il passaggio di lavaggio di purificazione dell’immunoaffinità.

Quindi aggiungere un millilitro di acqua HPLC fredda alle perline e mescolare invertendo cinque volte. Gira a 2.000 volte g per 30 secondi a quattro gradi Celsius. Aspirare l’acqua e ripetere il passaggio di lavaggio dell’acqua due volte in più.

Ruotare un tempo aggiuntivo a 2.000 volte g per 30 secondi a quattro gradi Celsius per raccogliere l’acqua rimanente nella parte inferiore del tubo. Con punte di caricamento in gel con punta piatta, aspirare l’acqua extra che ha raccolto. Fare attenzione a evitare di aspirare le perline.

Aggiungere 55 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,15% in acqua alle perline. Incubare le perline per 10 minuti a temperatura ambiente mentre si tocca occasionalmente il fondo del tubo per mescolare. Ruotare le perline a temperatura ambiente per 30 secondi in una centrifuga in miniatura.

Utilizzare una punta di caricamento del gel con punta piatta per trasferire i peptidi elusi in un nuovo tubo. Aggiungere 45 microlitri di acido trifluoroacetico allo 0,15% in acqua alle perline. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente mentre si tocca occasionalmente il fondo del tubo per mescolare.

Ruotare le perline a temperatura ambiente per 30 secondi nella centrifuga in miniatura. Rimuovere la seconda eluizione utilizzando una punta di caricamento del gel con punta piatta e combinarla con la prima eluizione. Ruotare i peptidi elusi combinati a 12.000 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente per pelletare eventuali perline che si traslochino.

Trasferire la soluzione del campione peptidico in un nuovo tubo da 500 microliter. Costruisci il metodo di caricamento per caricare le miscele peptidiche arricchite su un chip pre-colonna C18 e desalt i peptidi lavando con la fase A mobile a due microlitri al minuto per 10 minuti. Costruire il metodo cromatografico in modo che i peptidi siano trasferiti su una colonna analitica ed eluti a una portata di 300 nanolitri al minuto con un gradiente da due a tre ore utilizzando le fasi mobili A e B.In particolare, utilizzare un gradiente lineare dal 5% di fase mobile B al 35% di fase mobile B per 80 minuti.

Successivamente, far salire la fase mobile B all’80% in cinque minuti, quindi tenere premuto all’80%B per otto minuti prima di tornare al 5%B per un ri-equilibrazione di 25 minuti. Creare quindi un metodo di strumento MS per l’acquisizione dipendente dai dati. Per l’esperimento uno, impostare la scansione ionica precursore MS1 da M/Z 400 a 1.500.

Impostare la durata su 120 minuti. Creare un esperimento IDA e fare clic su OK. Nella scheda criteri switch impostare la soglia di intensità per attivare le scansioni MS/MS per gli ioni di stati caricati da due a cinque a 200 conteggi al secondo. Impostare l’esclusione dinamica degli ioni precursori su 60 secondi.

Per l’esperimento due, impostare la scansione ionica del prodotto MS/MS con un intervallo di scansione MS2 da M/Z 100 a 1.500. Fate clic su modifica parametri (Edit parameters) e impostate la diffusione dell’energia di collisione su cinque e selezionate la modalità di scansione ionica del prodotto ad alta sensibilità. Infine, inserire l’esempio nell’autocampionatore.

Inviare la coda di esempio e avviare i metodi di acquisizione LC-MS/MS per creare un metodo di strumento MS per l’acquisizione indipendente dai dati e definire due esperimenti di scansione dello strumento. Eseguire scansioni ioniche precursori MS1 da 400 a 1.250 massa per caricare e impostare la durata su 120 minuti. Impostare la diffusione dell’energia di collisione su 10 e il tempo di accumulo su 45 millisecondi, quindi selezionare la modalità di scansione ionica del prodotto ad alta sensibilità.

Importare quindi un file di testo contenente lo schema di acquisizione DIA SWATH a finestra variabile 64 per popolare le finestre di acquisizione SWATH nel metodo . In questo schema di acquisizione, le finestre variabili che vanno da cinque a 90 massa a carica e larghezza vengono passate in passaggi incrementali nell’intervallo di massa completo da 400 a 1.250 massa per caricarsi con un totale di 64 segmenti SWATH ciascuno con un tempo di accumulo di 45 millisecondi. Regolare il tempo di accumulo ms1 a 0,25 secondi.

Insieme, la scansione MS1 e 64 scansioni MS2 dovrebbero ora produrre un tempo di ciclo totale di 3,2 secondi. In questo studio, i risultati sperimentali hanno documentato la possibilità di rilevare e valutare il cross-talk PTM. Questa tabella mostra come la sequenza temporale del flusso di lavoro e le quantità di campione e proteine richieste.

Il metodo one-pot può essere eseguito in metà del tempo e con la metà del numero di campioni come questi metodi alternativi. Il coefficiente mediano di variazione per le aree peptidiche modificate era inferiore nel metodo a un vaso rispetto al singolo PTM e all’arricchimento seriale della PTM. Confrontando i metodi di arricchimento della PTM a un pentola e del singolo PTM, non sono emerse differenze degne di nota tra le correlazioni della quantificazione a livello di sito per le due modifiche.

Questa figura mostra i dati di un arricchimento riuscito e illustra un esempio per un peptide contenente più e diverse modifiche acili che visualizzano il cross-talk PTM. Un peptide è stato acetilato su un residuo di lisina e succinato dall’altro mentre qui lo stesso peptide è stato succinato in entrambe le lisina. Ciò dimostra che lo stesso residuo di lisina può essere modificato con entrambi i gruppi di acilazione e c’è la possibilità che si verifichino discorsi incrociati in quel sito.

È essenziale assicurarsi che ogni campione contenga la stessa quantità di perline e assicurarsi che nessuna delle perline venga aspirata accidentalmente durante il lavaggio delle perline di legame peptidico. La profilazione basata sulla spettrometria di massa e l’analisi dei dati in strumenti software come Spectronaut vengono eseguite seguendo questa procedura per identificare, quantificare ed eseguire la localizzazione del sito delle PTM. Questo flusso di lavoro di acquisizione indipendente dai dati in combinazione con l’arricchimento simultaneo di PTM aprirà strade per valutare in modo più efficiente il cross-talk PTM e fornire informazioni migliori sulla pertinenza della segnalazione PTM.