Biology
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量化和站点本地化两个翻译后修改的同步亲和力丰富
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Summary February 27th, 2020
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此工作流程描述了用于定量全球蛋白质组分析的多个蛋白质转化后修饰 （PTM） 的及时且经济高效的扩充性能。该协议利用肽级PTM富集与多个结合抗体，然后数据独立的采集质谱分析，以获得对PTM串扰的生物见解。
Transcript
该协议描述了与抗体同时富集多个PTM的新技术，然后进行数据独立采集质谱分析，以获得对位点定位和相声的生物洞察。这是一种具有时间和成本效益的技术，能够同时识别和定量多肽，切片含有乙酸和吸碱PTM，只有少量的样品输入。跟踪翻译后修改是描述和防治不同疾病状态的重要步骤。
我们已经知道，某些癌症和糖尿病通过这些蛋白质的修饰受到高度控制。该方法理论上可应用于任何具有富集抗体的PTM，如泛化、磷酸化等。它也可以应用于其他组织类型或细胞培养模型。
使用此技术获取有价值的数据的关键是可重复性。这可以通过确保所有步骤非常仔细地执行，特别是涉及抗体珠的步骤来实现。首先，获取含有C18树脂的墨盒，这些树脂结合到高达10毫克的蛋白质。
将这些墨盒安装到真空装置中。在19.8%的水中加入800微升80%乙酰酸和0.2%甲酸，开始真空吸气，将液体拉过。重复此步骤一次，避免完全干燥墨盒。
通过真空吸附在水中加入 800 微升 0.2% 甲酸，使墨盒与墨盒进行均衡。重复两次。将一毫克多肽在约1000微升溶液中装到真空吸气的墨盒上。
在真空吸水下用800微升0.2%的甲酸洗涤两次肽。然后在每个墨盒下方排列 1.5 毫升微离心管，以收集肽。在真空吸气下，首先从墨盒中去除800微升的80%乙酰酸和0.2%的甲酸，在19.8%的水中，然后用400微升相同的溶液。
在真空浓缩器中完全干燥脱盐肽样品两到三个小时。现在，将干燥的肽重新在1.4毫升的冷1X免疫仿纯缓冲液中重新填充。涡流混合，确保pH值约为7。
将样品以10，000倍g离心，在4摄氏度下10分钟。出现一个小颗粒。在准备抗体珠时，将肽放在冰上。
将一毫升冷1X PBS加入含有100微升K-乙酰抗体珠浆的管子和含有100微升K-succinyl抗体珠浆的管子，通过移液混合。将整个溶液转移到新的 1.5 毫升管中，并在微型离心机中旋转 30 秒，在室温下。吸气PBS小心，避免吸走任何珠子。
重复洗涤三次。接下来，将珠子重新在大约440微升PBS中重新发送。移液珠子几次混合好。
使用200微升预切技巧，将每个乙酰氨酸抗体珠和苏辛利氨酸抗体珠的100微升转移到一个新的管中。在微型离心机中旋转 30 秒，然后用凝胶装载机尖端吸气介质。珠子现在变白了。
将重新悬浮的肽直接放在洗涤的珠子上，在四摄氏度下一夜之间用珠子孵育肽。早晨，在4摄氏度下，在2000次g下旋转肽样品，30秒。取出含有未绑定肽的上能物质，如果需要，保存用于将来的实验。
在珠子中加入一毫升冷1X免疫仿纯液，通过倒置五次进行洗涤和混合。在4摄氏度下以2000倍g旋转30秒。吸掉免疫仿纯溶液，再重复免疫仿纯洗涤步骤。
然后将一毫升冷 HPLC 水加入珠子中，并反转五次。在4摄氏度下以2000倍g旋转30秒。吸水，再重复两次水洗步骤。
在4摄氏度下以2000次g旋转一次，30秒，收集管底中剩余的水。与平翻凝胶加载提示，吸走任何额外的水已经收集。小心避免吸珠子。
在水中加入55微升0.15%的三氟乙酸。在室温下孵育珠子10分钟，同时偶尔敲击管子底部进行混合。在室温下在微型离心机中旋转珠子30秒。
使用扁平的倾斜凝胶加载尖端将洗洗的肽转移到新管中。在水中加入45微升0.15%三氟乙酸。在室温下孵育10分钟，偶尔敲击管底混合。
在室温下在微型离心机中旋转珠子30秒。使用扁平的倾斜凝胶加载尖端拆下第二个洗脱，并将其与第一个洗脱相结合。在室温下将组合的洗出肽以12，000次g旋转5分钟，以将任何携带的珠子粒出。
将肽样品溶液转移到新的500微升管中。构建加载方法，将富集的肽混合物加载到 C18 预列芯片上，然后通过移动 A 阶段每分钟两微升洗涤 10 分钟，再次对肽脱盐。构建色谱法，使多肽以每分钟300纳米的流速转移到分析柱，使用移动相 A 和 B 的 2 到 3 小时梯度。
随后，将移动阶段 B 在五分钟内提升至 80%，然后在 80%B 下保持 8 分钟，然后返回 5%B 进行 25 分钟的重新平衡。接下来，构建一种 MS 仪器方法，用于数据相关采集。对于实验一，将MS1前体离子扫描从M/Z 400设置为1500。
将持续时间设置为 120 分钟。创建 IDA 实验，然后单击"确定"。在开关条件选项卡下，设置强度阈值以触发 MS/MS 扫描，以在 2 到 5 到 200 个计数之间触发 MS/MS 扫描。将前体离子的动态排除设置为 60 秒。
对于实验二，将 MS/MS 产品离子扫描设置为 MS2 扫描范围从 M/Z 100 到 1，500。单击编辑参数，将碰撞能量扩散设置为五，并选择高灵敏度产品离子扫描模式。最后，将样品放入自动采样器中。
提交示例队列并开始 LC-MS/MS 采集方法，构建 MS 仪器方法，用于数据独立采集并定义两个仪器扫描实验。执行 MS1 前体离子扫描从 400 到 1，250 质量充电，并设置持续时间为 120 分钟。将碰撞能量扩散设置为 10，累积时间设置为 45 毫秒，然后选择高灵敏度产品离子扫描模式。
接下来，导入包含 64 个变量窗口 DIA SWATH 采集方案的文本文件，以将 SWATH 采集窗口填充到方法中。在此采集方案中，从 5 到 90 质量到充电的可变窗口以增量步骤传递，在 400 到 1，250 质量的完全质量范围内充电，每个段总共有 64 个 SWATH 段，累积时间为 45 毫秒。将 MS1 累积时间调整为 0.25 秒。
MS1 扫描和 64 次 MS2 扫描现在应总共产生 3.2 秒的总周期时间。在这项研究中，实验结果记录了检测和评估PTM相声的可能性。此表显示工作流的时间表以及所需的样品和蛋白质量。
单锅方法可以在一半的时间执行，样本数的一半可以作为这些替代方法执行。在单锅法中，改性肽区域的中值变异系数低于单一PTM和串行PTM富集。在比较单锅PTM和单一PTM浓缩方法时，两种修改的站点级定量相关性没有明显差异。
此图显示成功浓缩的数据，并说明了包含多个和不同交流修饰的肽示例，该修饰图显示 PTM 相声。一种肽在一个裂氨酸残留物上乙酰化，并在另一个裂谷素上被苏奇林化，而在这里，同样的肽在两个裂酸被苏奇林化。这表明，相同的Lysine残留物可以同时使用两个同化组进行修饰，并且有可能在该站点发生相声。
必须确保每个样品都含有相同数量的珠子，并确保在洗涤肽键珠时，没有一个珠子意外吸气。在软件工具（如 Spectronaut）中，基于质谱的分析和数据分析按照此过程执行，以识别、量化和执行 PPTM 的站点定位。这种独立于数据的采集工作流与同时进行 PTM 扩充相结合，将打开途径，更高效地评估 PTM 相声，并提供有关 PTM 信令相关性的更好见解。
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