Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Samtidig affinitetberikelse av to post-translational modifikasjoner for kvantifisering og lokalisering av nettstedet
Chapters
Summary February 27th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne arbeidsflyten beskriver ytelsen til tids- og kostnadseffektiv berikelse av flere proteinpost-translational modifikasjoner (PTMs) samtidig for kvantitativ global proteomisk analyse. Protokollen benytter ptm berikelse på peptidnivå med flere konjugerte antistoffer, etterfulgt av datauavhengig oppkjøpsmassespektrometrianalyse for å få biologisk innsikt i PTM crosstalk.
Transcript
Denne protokollen beskriver den nye teknikken for samtidig berikelse av flere PTMer med antistoffer etterfulgt av datauavhengig oppkjøp massespektrometri analyse for å få biologisk innsikt i lokalisering og kryss-snakk. Dette er en tid og kostnadseffektiv teknikk som muliggjør samtidig identifisering og kvantifisering av peptider med kutting som inneholder acetylering og kortfattet PTMer med bare små mengder prøveinndata. Sporing av endringer etter oversettelsen er et viktig skritt for å karakterisere og bekjempe ulike sykdomsstater.
Vi er allerede klar over at visse kreftformer og diabetes er sterkt regulert gjennom disse proteinmodifikasjonene. Denne metoden kan teoretisk gjelde for alle PTMer med antistoffer for berikelse som ubiquitination, fosforylering og andre. Det kan også gjelde for andre vevstyper eller cellekulturmodeller.
Nøkkelen til å skaffe verdifulle data ved hjelp av denne teknikken er reproduserbarhet. Dette kan oppnås ved å sikre at alle trinnene utføres svært nøye, spesielt trinnene som involverer antistoffperlene. Til å begynne med, få patroner som inneholder C18 harpiks som kombinerte opptil 10 milligram protein.
Sett disse patronene i et vakuumapparat. Tilsett 800 mikroliter med 80 % acetonitril og 0,2 % maursyre i patronene med 19,8 % vann og start vakuumsuging for å trekke væsken gjennom. Gjenta dette trinnet én gang for å unngå å tørke patronene helt.
Likevekt patronene ved å tilsette 800 mikroliter med 0,2 % maursyre i vann med vakuumsuging. Gjenta dette to ganger. Legg ett mg peptider i ca. 1 000 mikroliter på patronene med vakuumsuging.
Vask peptidene to ganger med 800 mikroliter på 0,2 % maursyre i vann under vakuumsuging. Deretter ordner du 1,5 milliliter mikrocentrifugerør under hver sylinderampulle for å samle opp peptidet. Under vakuumsuging, elute peptider fra patroner først med 800 mikroliter på 80% acetonitril og 0,2% maursyre i 19,8% vann deretter med 400 mikroliter av samme oppløsning.
Tørk de avsaltede peptidprøvene helt i en vakuumkonsentrator i to til tre timer. Nå, resuspend tørkede peptider i 1,4 milliliter kald 1X immunoaffinity rensing buffer. Vortex å blande og sikre en pH på ca 7.
Sentrifuger prøvene ved 10 000 ganger g i 10 minutter ved fire grader Celsius. En liten pellet vises. Sett peptidene til side på is mens du forbereder antistoffperler.
Tilsett en milliliter kald 1X PBS til et rør som inneholder 100 mikroliter k-acetyl antistoff perle slurry og et rør som inneholder 100 mikroliter k-succinyl antistoff perle slurry og bland ved pipettering. Overfør hele løsningen til nye 1,5 ml ml og spinn i en miniatyr sentrifuge i 30 sekunder ved romtemperatur. Aspirer PBS tar vare på å unngå aspirering av perler.
Gjenta vasken tre ekstra ganger. Deretter bruker du perlene på ca. 440 mikroliter pbs. Pipette perlene flere ganger for å blande godt.
Med 200 mikroliter forhåndssnittspisser overfører du 100 mikroliter av hver acetyllysinantistoffperler og kortsinusantistoffperler til et nytt rør. Spinn ned i 30 sekunder i en miniatyr sentrifuge og aspirer av media med en gel loader tips. Perlene blir nå hvite.
Pipette det resuspended peptid direkte på vasket perler og inkubere peptidene med perler på fire grader Celsius over natten med agitasjon. Om morgenen spinner du peptidprøvene ved 2000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Fjern supernatant som inneholder ubundne peptider og lagre for fremtidige eksperimenter hvis ønskelig.
Tilsett en milliliter kald 1X immunoaffinitetsrensingsbuffer til perlene for å vaske og blande ved å invertere fem ganger. Spinn på 2, 000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Aspirer av immunoaffinitetsrenseløsningen og gjenta immunoaffinitetsrensingsvask trinn en gang til.
Tilsett deretter ett milliliter kaldt HPLC-vann til perlene og bland ved å invertere fem ganger. Spinn på 2, 000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius. Aspirer av vannet og gjenta vannvasktrinnet to ekstra ganger.
Spinn en ekstra tid på 2 000 ganger g i 30 sekunder ved fire grader Celsius for å samle gjenværende vann i bunnen av røret. Med flate spisse gellastetips, aspirer av ekstra vann som har samlet seg. Vær forsiktig så du unngår å aspirere perlene.
Tilsett 55 mikroliter med 0,15% trifluorotaktisk syre i vann til perlene. Inkuber perlene i 10 minutter ved romtemperatur mens du av og til trykker på bunnen av røret for å blande. Spinn perlene ved romtemperatur i 30 sekunder i en miniatyr sentrifuge.
Bruk en flat tippet gel lasting tips for å overføre eluted peptider til et nytt rør. Tilsett 45 mikroliter med 0,15% trifluorotaktisk syre i vann til perlene. Inkuber i 10 minutter ved romtemperatur mens du trykker på bunnen av røret av og til for å blande.
Spinn perlene ved romtemperatur i 30 sekunder i miniatyr sentrifuge. Fjern den andre elution ved hjelp av en flat tippet gel lasting tips og kombinere den med den første elution. Spinn de kombinerte eluted peptidene på 12 000 ganger g i fem minutter ved romtemperatur for å pellet noen perler som bærer over.
Overfør peptidprøveløsningen til et nytt 500 mikroliterrør. Bygg lastemetoden for å laste de berikede peptidblandingene på en C18-forkolonnebrikke og desalt peptidene igjen ved å vaske med mobil fase A ved to mikroliter per minutt i 10 minutter. Bygg kromatografimetoden slik at peptider overføres til en analytisk kolonne og elute med en strømningshastighet på 300 nanoliter per minutt med en to til tre timers gradient ved hjelp av mobilfaser A og B.Spesielt, bruk en lineær gradient fra 5% mobil fase B til 35% mobil fase B over 80 minutter.
Deretter rampe mobil fase B til 80% over fem minutter deretter holde på 80% B i åtte minutter før du går tilbake til 5% B for en 25-minutters re-likevekt. Deretter bygger du en MS-instrumentmetode for dataavhengig anskaffelse. For eksperiment én setter du opp MS1-forløperionskanning fra M/Z 400 til 1 500.
Angi varigheten til 120 minutter. Opprett et IDA-eksperiment, og klikk på OK. Under kategorien Bryterkriterier angir du intensitetsterskelen for å utløse MS/MS-søk etter ioner av ladede tilstander mellom to til fem til 200 tellinger per sekund. Angi dynamisk ekskludering av forløperioner til 60 sekunder.
For eksperiment to angir du MS/MS-produktionskanning med et MS2-skanneområde fra M/Z 100 til 1 500. Klikk på rediger parametere og sett kollisjonsenergispredningen til fem, og velg skannemodus for høysensitivitetsproduktion. Til slutt plasserer du prøven i autosampleren.
Send inn eksempelkøen og start LC-MS/MS-anskaffelsesmetoder som bygger en MS-instrumentmetode for datauavhengig anskaffelse og definerer to eksperimenter for instrumentskanning. Utfør MS1-forløperionskanninger fra 400 til 1 250 masse for å lade og angi varigheten til 120 minutter. Sett kollisjonsenergien spredt til 10 og akkumuleringstid til 45 millisekunder, og velg deretter skannemodus for høy følsomhetsproduktion.
Deretter importerer du en tekstfil som inneholder 64 variabelvinduet DIA SWATH oppkjøp ordningen for å fylle SWATH anskaffe vinduer inn i metoden. I denne oppkjøpsordningen sendes variable vinduer fra fem til 90 masse til lading og bredde i trinnvise trinn over hele masseområdet på 400 til 1 250 masse for å lade med totalt 64 SWATH-segmenter hver med en 45 millisekund akkumuleringstid. Juster MS1-akkumuleringstiden til 0,25 sekunder.
Sammen bør MS1-skanningen og 64 MS2-skanninger nå gi en total syklustid på 3,2 sekunder. I denne studien dokumenterte eksperimentelle resultater muligheten for å oppdage og vurdere PTM cross-talk. Denne tabellen viser hvordan tidslinjen for arbeidsflyten og mengdene prøve og protein som kreves.
En-pot metoden kan utføres i halvparten så mye tid og med halvparten av antall prøver som disse alternative metodene. Median variasjonskoeffisient for de modifiserte peptidområdene var lavere i én grytemetoden enn i enkelt-PTM- og seriell PTM-berikelse. Mens du sammenligner en-pot PTM og enkelt PTM berikelse metoder, ingen bemerkelsesverdige forskjeller var tydelig mellom korrelasjonene av stedsnivå kvantifisering for de to modifikasjonene.
Denne figuren viser data fra en vellykket berikelse og illustrerer et eksempel for et peptid som inneholder flere og forskjellige acyl modifikasjoner visualisere PTM cross-talk. Et peptid ble acetylated på en lysin rester og konsistret på den andre mens her samme peptid ble konsistret på begge lysiner. Dette viser at de samme lysinrester kan endres med både acylation grupper, og det er en mulighet for kryss-snakk skjer på det stedet.
Det er viktig å sørge for at hver prøve inneholder samme mengde perler og sørge for at ingen av perlene aspireres ved et uhell når du vasker peptidbindingsperler. Massespektrometribasert profilering og dataanalyse i programvareverktøy som Spectronaut utføres etter denne fremgangsmåten for å identifisere, kvantifisere og utføre lokalisering av PTMer. Denne datauavhengige oppkjøpsarbeidsflyten i kombinasjon med samtidig PTM-berikelse vil åpne veier for å vurdere PTM-krysssnakk på en mer effektiv måte og gi bedre innsikt i relevansen av PTM-signalering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
