Kombinert betinget knockdown og tilpasset sfæreformasjonsanalyse for å studere et stemness-assosiert gen av pasientavledede magekreft stamceller

Kreft stamceller er innblandet i kreft tilbakefall metastase på legemiddelresistens. Denne protokollen gir en effektiv metode for å undersøke funksjonene til viktige gener i kreftstamceller. Ved hjelp av et betinget knockdown-system og tilpasset sfæreformasjonsanalyse, er denne metoden lett tilpasset for å studere in vitro og in vivo-funksjoner på stemness-assosierte gener i ulike typer kreftstamceller.

Demonstrere prosedyren, vil være Yuting Li og Xiangyu Tan, forskningsassistenter fra laboratoriet mitt. For å generere lentiviruspartikler, frø fire millioner 293T lentiviral emballasjeceller i en 100 millimeter Petri skål med 10 milliliter DMEM supplert med 10% FBS. Inkuber cellene over natten ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, og pass på at cellene er 50 til 80% samløpet på dagen for transfeksjon.

Ta med redusert serummedium til romtemperatur og klargjør rør A og B i henhold til manuskriptretninger. Tilsett innholdet i røret A til tube B.Bland godt og inkuber røret i 15 minutter ved romtemperatur for å forberede lipid-DNA-komplekser. Fjern fem milliliter medium fra cellekulturfatet.

Tilsett deretter fem milliliter av lipid-DNA-komplekset i cellekulturen parabolen dråpe klok og forsiktig virvle parabolen. Inkuber kulturretten i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5%karbondioksid. Etter inkubasjonen, fjern forsiktig transfeksjonsmediet og bytt det ut med 10 milliliter forhåndsoppvarmet DMEM supplert med 10% FBS.

Inkuber cellene i ytterligere 24 timer. Omtrent 48 timer etter transfeksjon, høst 10 milliliter lentivirus som inneholder supernativa og filtrere dem med et 0,45 mikrometer hellefilter for å fjerne cellulært rusk. Alle cellekulturkar, tips, filtre og sprøyter kan inneholde lentivirus og bør behandles med 10% blekemiddel før avhending.

Overfør en avklart supernatant til en steril beholder. Tilsett Lenti-X konsentrator og bland med mild inversjon. Inkuber blandingen ved fire grader Celsius over natten.

På neste dag sentrifuger prøven på 1500 ganger G i 45 minutter ved fire grader Celsius. Fjern forsiktig overnatanten, og ta vare på å ikke forstyrre pelleten nederst. Forsiktig re-suspendere pellet i en milliliter DMEM supplert med 10% FBS og lagre den på minus 80 grader Celsius.

Seed 6 millioner magekreft stamceller eller GCSC er i en 100 millimeter Petri skål med 10 milliliter DMEM supplert med 10% FBS. Kultur cellene i 24 timer ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid. Når cellene når 70 til 80% samløpet, aspirer mediet fra parabolen og tilsett konsentrerte lentiviralpartikler fortynnet med fire millimeter komplett DMEM medium, som inneholder polybrenereagens.

Returner cellene til inkubatoren i 18 timer. Polybrene bør testes under forskjellige forhold for å bestemme den effektive konsentrasjonen, som vanligvis er i området to til 10 mg per milliliter. Etter 18 timer, erstatt mediet med 10 milliliter DMEM med 10% FBS og returnere cellene til inkubatoren i 24 timer.

Deretter aspirerer du overnatanten med celleavfallet og legger til fersk DMEM supplert med 10% FBS og 2,5 mikrogram per milliliter puromycin. Inkuber cellene i ytterligere 24 timer. Deretter endrer du mediet igjen til fersk DMEM supplert med 10% FBS og fem mikrogram per milliliter puromycin.

Etter ytterligere 24 timers inkubasjon, skyll de tilslutningen gCS to ganger med fem milliliter DPBS uten kalsium og magnesium. Dissosier cellene med en milliliter forhåndsoppvarmet celledissosiasjonsløsning og inkuber dem i to til tre minutter ved 37 grader Celsius. Deretter legger du til fem milliliter med fersk pre-oppvarmet GCSC komplett kultur medium til celle suspensjon.

Dispenser tre milliliter av denne suspensjonen i et 15 milliliter sentrifugerør for kryopreservasjon, og de tre andre milliliter i et annet rør for induksjon med doxycyklin. Sentrifuge begge rørene på 800 ganger G i fem minutter. Deretter aspirerer du supernatanten fra rør B og re-suspendere cellene i en milliliter frisk pre-oppvarmet GCSC komplett kultur medium.

Seed et passende antall celler i en ny 100 millimeter Petriskål med 10 milliliter fersk pre-oppvarmet GCSC komplett kultur medium og 2,5 mikrogram per milliliter doxycyklin. Deretter inkubere parabolen i 48 timer. Bruk en automatisert celleteller til å bestemme tettheten til en 10 mikroliters prøve av celler.

Juster deretter volumet med forhåndsoppvarmet GCSC komplett kulturmedium for å oppnå en konsentrasjon på 20 000 levedyktige celler per milliliter. Dispenser 100 mikroliter av cellefjæringen i hver brønn av en ny, ultraliv vedlegg 96 brønnkulturplate. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius med 5%karbondioksid.

Sfæredannelse bør skje innen tre til 10 dager. Bilde tumorsfæreformasjonen annenhver dag. Stamceller av magekreft fra primært humant mageadenokarsinom ble dyrket i serumfri kulturmedium.

Etter seks dager ekspanderte celler fra encellet som fenotype til store kuler. For å vurdere funksjonen til clusterin i GCSCs, ble korte hårnål RNA-sekvenser mot clusterin klonet inn i Tet-GV307-RFP-Puro-vektoren. Celler som ble transfisert med uttrykksvektoren ble behandlet med doxycyklin i 48 timer.

Deretter ble clusterin uttrykk verifisert av vestlig flekk og kvantifisert av densitometry. Tilstedeværelsen av doxycyklin og knockdown av clusterin i GCSCs hemmet tumorsfæredannelse. Mens ingen hemming av tumorsfæredannelse ble observert i celler som ble transdusert med de krypterte shRNA-kontrollene, noe som indikerer at doxycyklin alene ikke hemmet tumorsfæredannelse.

Disse resultatene tyder på at etter clusterin deaktivering, GCScs vokse sakte og kan ikke danne tumorkuler. Basert på disse dataene spiller clusterin en avgjørende rolle i å fremme selvfornyelsesaktiviteten til GCSCs, noe som indikerer at det kan være et lovende legemiddelmål for å undertrykke kreftstamceller hos magekreftpasienter. Svulstene sfærer bør være solide runde strukturer på individuelle eller aggregerte celler, bør ikke betraktes som tumorkuler.

Noen kreftstamceller kan imidlertid ikke danne typiske tumorsfærestrukturer. Denne prosedyren kan følges med andre metoder for å undersøke kreft stamcelle for fornybar potensial in vitro. Uttrykket for stemness-relaterte markører kan for eksempel studeres.

Protokollen kan utvides for å studere funksjonene til de kritiske genene i kreftstamceller som stemness på overlevelse.