Identificazione del recettore della superficie cellulare utilizzando schermi genetici CRISPR/Cas9 su scala genomica

Il rilevamento delle interazioni tra superfici cellulari utilizzando approcci biochimici attualmente disponibili pone ancora sfide tecniche. Questo protocollo fornisce un’alternativa genetica utilizzando l’approccio di screening cellulare su scala genomica per identificare le interazioni del ligando recettore sulla superficie cellulare. A differenza della maggior parte degli altri metodi esistenti, questo metodo non fa ipotesi riguardo alla biologia dei recettori.

Fornisce l’opportunità di identificare le interazioni mediate da una vasta gamma di molecole di superficie cellulare. Le molecole di superficie cellulare sono direttamente accessibili a farmaci come gli anticorpi monoclonali. Pertanto, l’identificazione delle interazioni mediate da queste molecole può avere importanti implicazioni terapeutiche.

Questo metodo è generalmente applicabile ai ricercatori interessati ad esplorare i processi di segnalazione e riconoscimento cellulare in una vasta gamma di contesti biologici, comprese le interazioni neurali e immunologiche e le interazioni patogene ospiti. Il protocollo richiede una macchina di smistamento delle celle ad alta velocità effettiva e macchine di sequenziamento di nuova generazione. Assicurarsi che queste strutture siano disponibili prima di avviare il protocollo.

Iniziare effettuando otto diluizioni seriali dei campioni di proteine biotinilate in una piastra da 96 porri garantendo che il volume finale di ogni diluizione sia di almeno 200 microlitri e che sia incluso un controllo solo tag. Creare una piastra duplicata dei campioni rimuovendo 100 microlitri da ogni pozzo e trasferendolo in una nuova piastra da 96 porri. Includere un controllo proteico solo tag che verrà utilizzato come sonda di controllo in tutti i saggi di associazione.

Aggiungere 100 microlitri da 0,1 microgrammi per millilitro streptavidin-PE ai pozzi di una delle piastre e 100 microlitri di tampone di diluizione ai pozzi dell’altra piastra. Incubare la piastra per 20 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, bloccare i pozzi della piastra codificata con streptavidina con il tampone di diluizione per 15 minuti.

Dopo aver lavato il piatto, assicurarsi che sia asciutto. Quindi trasferire il volume totale del campione da entrambe le piastre ai singoli pozzi della piastra codificata streptavidina e incubarlo per un’ora a temperatura ambiente. Dopo l’incubazione, lavare la piastra tre volte con 200 microlitri di tampone di lavaggio.

Aggiungere 100 microlitri di Topo anti-ratto Cd4d3+4 IgG E incubare la piastra per un’altra ora. Ripeti i lavaggi. Aggiungere 100 microlitri di un coniugato di fosfatasi alcalina anti-topo e lasciare la piastra a temperatura ambiente per un’ora.

Quindi lavare i pozzi tre volte con tampone di lavaggio e una volta con tampone di diluizione. Preparare il fosfato p-nitrofenile a un milligrammo per millilitro nel tampone di etanolammina colorante e aggiungere 100 microlitri ad ogni pozzo. Dopo un’incubazione di 15 minuti, misurare l’assorbanza hanno ciascuno bene a 405 nanometri.

Utilizzare la diluizione minima alla quale non c’è segnale sulla piastra come fattore di diluizione appropriato per creare tetrameri. Incubare la streptavidina-PE e l’appropriata diluizione proteica biotinilata per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi conservare le proteine coniugate in un tubo protetto dalla luce a quattro gradi Celsius fino a un ulteriore utilizzo.

Ruotare i tubi conici con i campioni trattati e controllare a 200 volte G per cinque minuti. Rimuovere il supernatante e congelare uno dei tubi a meno 20 gradi Celsius per un uso successivo. Sospendere di nuovo il pellet nell’altro tubo in 10 millilitri di PBS con 1%BSA e mettere da parte 100 microlitri di cellule come controllo negativo su una piastra da 96 pompoli.

Quindi aggiungere la proteina ricombinante pre-coniugata alla sospensione cellulare nel tubo conico e nella piastra a 96 po ‘. Eseguire la colorazione cellulare per almeno un’ora a quattro gradi Celsius su un rotore da banco con una rotazione delicata. Quindi pellettare le cellule a 200 volte G per cinque minuti e rimuovere il supernatante.

Dopo aver lavato le cellule due volte, sospenderle in cinque millilitri di PBS. Filtrare le cellule attraverso un colino di 30 micrometri per rimuovere i cluster cellulari. Quindi analizzali con un flusso Sodor.

Utilizzare il campione di controllo negativo per gate per le celle positive bfp e pe negative. Quindi ordinare il campione e raccogliere da 500.000 a 1 milione di cellule positive e PE negative BFP in un tubo di centrifugazione da 1,5 millilitri. La gabbia dolorante dipenderà dal legame delle cellule con la proteina, ma normalmente vengono raccolti uno-5% dei campioni negativi di PE.

Ora lasciare che le cellule ordinate centrifughino per 500 volte G per cinque minuti, quindi rimuovere con cura il supernatante. Il pellet può essere conservato a meno 20 gradi Celsius per un massimo di sei mesi. Utilizzare la funzione conteggio della magia per mappare le sequenze dalla popolazione non ordinata e ordinata alla libreria di riferimento, che produrrà un file di conteggio non elaborati.

Eseguire la funzione di test della magia utilizzando conteggi non elaborati dal campione di controllo non ordinato come controllo e i conteggi dal campione ordinato come trattamento. Aprire il file di riepilogo genico generato e classificare la colonna della classificazione di pausa in ordine crescente. Identificare quindi i riscontri con un tasso di individuazione falso inferiore al punto 0.05.

Il recettore è solitamente classificato molto spesso in prima posizione. Infine utilizzare R o un software equivalente per tracciare il robusto punteggio dell’algoritmo di classificazione per la selezione positiva. Gli schermi di abbattimento su scala genomica per l’identificazione del partner legante del TNFSF9 umano e del P falciparum o H5 del TNFSF9 umano e del P falciparum Rh5 sono stati eseguiti rispettivamente nelle cellule NCI-SNU-1 e HEC-293.

Il comportamento di legame di Rh5 è stato influenzato sia dal solfato eparano che dal suo noto recettore BSG, mentre il TN-FRSF-9 non ha perso il legame con il suo noto recettore TN-FSF-9. Dopo la pre-incubazione con eparina solubile. La distribuzione GNA nella libreria mutante di controllo rivelò che la complessità della biblioteca fu mantenuta per tutto il corso dell’esperimento.

La qualità tecnica degli schermi è stata valutata esaminando la distribuzione dei cambiamenti di piegatura osservati del G-RNA mirati a un insieme di riferimento di geni non essenziali, rispetto alla distribuzione per un insieme di riferimento di geni essenziali. Inoltre, l’arricchimento a livello di percorso ha rivelato che i percorsi essenziali previsti sono stati identificati e significativamente arricchiti nella popolazione di abbandono scolastico. Quando si confronta il campione di controllo con la libreria plasmide originale.

Il robusto algoritmo di classificazione o RRA-score fornisce una misura di cui i G-RNA sono costantemente classificati più in alto del previsto. Nella schermata di TNFRSF9, il colpo più alto è stato TNFSF9, che è un partner di binding noto. Inoltre, sono stati identificati anche un certo numero di geni legati alla via TP53.

Nel caso di RH5, oltre al recettore noto e al gene richiesto per la produzione di gag solfate, è stato identificato anche il gene SLC16A1. L’approccio di screening è di solito molto robusto e il recettore interagente direttamente dovrebbe essere altamente classificato nella lista dei geni arricchiti in questo ordine di popolazione. È fondamentale convalidare i risultati ottenuti dallo schermo.

Se l’interazione è mediata da proteine, gli approcci biochimici progettati per studiare le interazioni binarie delle proteine proteiche, ad esempio, potrebbero essere utilizzati per ulteriori studi di convalida. A causa della natura imparziale della scala genomica di questo approccio, prevediamo che aii contribuirà ad esplorare le interazioni mediate da molecole cellulari difficili da studiare come lipidi, proteine della membrana multipass e glicani. Può anche rivelare nuovi percorsi necessari per il traffico di recettori e la biologia.