Genetics
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Summary April 2nd, 2020
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在这里，我们提出了一种用于冷冻保存单细胞胚胎的改良方法，以及一种用于使用冷冻解冻胚胎和电穿孔以有效生成转基因小鼠的协议。
Transcript
我们的协议有助于从单细胞小鼠胚胎轻松、高效和快速地制备转基因小鼠。我们的协议结合了冷冻解冻单细胞阶段胚胎和电穿孔的使用，允许快速生成转基因小鼠，包括高效和低马赛克率的突变小鼠。对于体外受精，首先通过7.5国际单位的怀孕母马血清腺腺激素的内向性注射，开始超级排卵4周或8周大的雌性C57BL/6J小鼠，48小时后再进行7.5国际单位的人类胆管性腺量腺激素注射。
接下来，从性成熟三到五个月大的雄性C57BL/6J小鼠身上取出卡乌达表皮，并使用解剖针提取精子的血块。然后在37摄氏度下孵育200微升HTF和5%二氧化碳的血块，1.5小时进行封顶。人类胆碱性腺激素注射后16至18小时，从细胞收集积液卵母细胞复合物，用200微升HTF覆盖的HTF细胞孵化，在细胞培养箱中孵化不超过两个小时。
在孵化结束时，将一至五微升精子悬浮液从孵化媒介的边界添加到200微升的积卵细胞复合物滴中，并将联合培养物放在细胞培养孵化器中三小时。在孵化结束时，用钾补充的简单细胞优化介质三次清洗卵母细胞，去除任何剩余的精子和积液细胞，并使用倒置显微镜检查单细胞胚胎的亲核形成和等级。对于一个细胞胚胎冷冻保存，将胚胎移植到新鲜200微升的HTF滴中，辅以20%的胎儿牛血清，在细胞培养箱中孵化10分钟。
在孵育结束时，将20至100个胚胎转移到50微升的一个摩尔二甲基硫化物溶液中，并在5微升溶液中移植至冷冻管底部的100个胚胎。在零摄氏度下冷却胚胎5分钟，然后将45微升DAP213溶液加入管侧。封盖后，在零摄氏度下将细胞再保留五分钟，然后快速将管子储存在液氮中。
在减少的血清最小基本介质中，每微升CRISPRRNA准备1微克，每微升1微克。在每个RNA溶液中加入6微升，加入42微升无核酸酶缓冲液，并在95摄氏度下将混合物放入干燥加热器中3分钟。在孵化结束时，在室温下冷却混合物五分钟，用减少的血清最小基本介质，每微升高一微克高一微克的HiFi Cas9蛋白。
将稀释的HiFi Cas9溶液的6微升加入RNA溶液中，并在一个整张玻璃幻灯片中将多达100个解冻胚胎转移到由此产生的核糖核蛋白复合溶液的25微升中。然后在37摄氏度下孵育胚胎10分钟。对于胚胎电穿孔，在孵育结束时，设置电穿孔器参数，然后将幻灯片加载到电穿孔器上。
电穿孔应在胚胎解冻后一小时内进行，以确保在第一次复制DNA之前进行基因组编辑，并防止马赛克。电穿孔后，用经过改良的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液两种介质洗三次，用一滴钾补充的单纯的优化介质，用液体石蜡覆盖。然后在细胞培养培养箱中孵育新鲜钾补充简单优化培养的胚胎。
对单细胞胚胎采用这种经过改良的冷冻保存方法，可提高冷冻冷冻胚胎发育速度至双细胞阶段。使用这种方法，在这个代表性实验中生成的所有小鼠都是白化病，只有一只马赛克小鼠携带白色和黑色斑块的外衣。在这里，可以观察到含有M1等位基因的白化病小鼠的色谱图的代表性部分。
如图所示，该协议可以产生敲击和敲击鼠标与高效率和低镶嵌率。事实上，同源F0后代的F1后代是异质体，含有一个突变体和一种野生型等位基因，没有不同的突变。请记住，受精卵在单细胞阶段是脆弱的。
胎儿牛血清的加入可强化胚胎。但是，必须在每个步骤中小心处理。这种方法有助于基因功能分析和人类疾病研究，促进转基因小鼠更快、更高效地生产。
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