Biology
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Summary June 11th, 2020
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我们描述了利用前活体成像系统进行细胞穿透肽的转导程度，然后采用心脏靶向肽进行石蜡嵌入、切片和共聚焦荧光显微镜的协议。在我们的协议中，单个动物可用于获得同一器官的两种成像评估，从而将研究所需的动物数量减少一半。
Transcript
我们的协议允许我们跟踪生物分布，并使用两种独立但互补的方法确认感兴趣的肽的组织特异性内化。我们可以使用此协议最大化从单个动物获得的数据，并获取定量轴向荧光成像数据。此外，我们可以获得定性显微镜图像。
在从肽合成设施获得含有Cy5.5标签的N-术语的固体相合成C-Terminus酰胺帽CTP后，在二甲基硫化物中制造一或10毫摩尔的CTP溶液，储存在零下80摄氏度的温度下，防止光线。在实验当天，将每公斤剂量的 Cy5.5 CTP 中 200 微升 PBS 中 10 毫克的 Cy5.5 CTP 加载到胰岛素注射器中。称体重鼠标，静脉注射肽到麻醉的六周大雌性CD1小鼠。
允许肽在预先指定的实验时间内循环，然后使用高流量CO2室对小鼠实施安乐死，并使用剪刀打开胸腔，并在右中庭的侧向自由壁中发出小刻痕。使用装有26分针的5毫升注射器，通过左心室顶点将三毫升10%缓冲的甲酸磷酸盐缓冲成分之一，以固定组织并清除任何红血球。然后将心脏、肺、肝脏、肾脏、脾脏、大肠和小肠、膀胱、卵巢或睾丸和大脑收集到12孔板的单个孔中，用于外活体光学成像。
对于 CTP 转导图像的体内成像，启动图像采集软件并单击初始化以准备成像系统。打开成像向导并选择荧光和滤镜对。单击名称、染料、氰化物和 Cy5 以设置激发和发射参数。
然后单击"手动设置"将曝光设置为一秒，将装箱设置为小，将 F/Stop 设置为 8，将视场设置为 15 厘米。单击"获取"并设置要在其中保存示例的文件夹。在编辑图像标签窗口中添加相应的实验信息，然后单击"确定"。将显示获取的图像。
将单位设置为辐射效率。双击图像，然后单击"修正"和"自适应荧光背景减法"。调整阈值，只覆盖紫色感兴趣的器官。
或者，右键单击并选择"裁剪区域"以绘制包含所有感兴趣样本的框。获得所有图像后，将样品转移到含有 10% 缓冲的甲酸磷酸盐的闪烁小瓶中，体积至少是组织的 20 倍，并在室温下将组织存放在不受光线保护的室温下至少 48 小时。要量化图像，请将单位设置为辐射效率和感兴趣区域为四比三。
调整兴趣区框以均匀覆盖所有油井，然后单击"测量感兴趣区域"。然后单击"感兴趣区域测量"以匹配感兴趣区域的单元格，然后单击"导出"以将数据保存在文本或 CSV 文件中。当器官在至少48小时后被充分固定时，将样品转移到组织处理和嵌入盒式磁带中，并将盒式磁带加载到组织加工机中。
将处理器设置为使用乙醇脱水组织，然后通过两次 30 分钟的二甲苯处理和石蜡输液以及四次 30 分钟的石蜡处理进行清除。最后一次石蜡处理后，从加工机中取出组织。将组织放在单独的金属模具中，用熔融石蜡将每个模具线。
将模具放在冷板上。当模具底部的石蜡开始凝固时，将器官放入石蜡中。当所有器官都放置后，在模具上放置一个标有卡带作为衬垫，用熔融石蜡填充模具。
让石蜡冷却，直到固体之前，存储块在零下20摄氏度过夜。第二天早上，设置了一个微切子，叶片角度为6度，部分厚度为10微米，将组织块安装到显微原子中。开始切割，直到获得含有组织的部分，将方块面朝下放在38摄氏度的蒸馏水浴中5分钟，或直到组织吸收了一些水分。
当组织的白色薄轮廓出现在方块中时，将组织放在平坦的冰块上 10 分钟，然后以与刚加载的方向返回微原子。开始获取切片，允许截断部分形成 6 到 10 个部分的长功能区。为确保组织部分采集成功，请保持块水合。
如果截面质量差或开始下降，请将方块返回冰块。丢弃次优石蜡带，直到产生足够长度的高质量色带以覆盖幻灯片。使用钝边将质量丝带转移到 38 摄氏度的水浴中，让部分位于蒸馏水的表面，直到它们平滑。
将扁平部分漂浮到干净的玻璃滑梯表面，在 65 摄氏度的烤箱中融化蜡 30 分钟。要使幻灯片脱丙二苯并次，每次处理用二甲苯对样品进行三次处理，10分钟。在最后一次二甲苯处理后，按照所示，用5分钟的降乙醇浸入水重新补充组织，然后浸入三分缓冲的盐水中5分钟。
在允许幻灯片在夜间干燥后，安装带盖玻片和 125 微升安装介质的分片，并经 DAPI 补充，在通过荧光显微镜成像之前，将幻灯片在夜间干燥，防止光线。固定后，实验动物的心脏、肺、肝、肾、脾、脑被安排在一个12井板中，用于外活光学荧光成像。将计数转换为辐射效率后，可对每组器官的荧光数据进行量化。
需要注意的是，不同的器官会表现出自动荧光，以响应不同的激发波长。较短的激发波长，如增强的绿色荧光蛋白，与高浓度的自身荧光相关，特别是在肝脏和大脑中，比远红色或近红外激发波长高。每个器官组织部分的固定和石蜡嵌入允许对感兴趣的细胞标记进行免疫氟化学分析，以及在每个组织内对感兴趣的免疫或频闪细胞进行定量。
调整成像设置以避免饱和并跟踪设置，然后将相同的采集设置应用于同一实验中的其他样本，以确保一致性和准确性。如果候选细胞穿透肽与感兴趣的结构或蛋白质共同局部，也可以在组织部分进行免疫组织化学。
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