Neuroscience
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Lésion cérébrale induite au laser dans le cortex moteur des rats
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Summary September 26th, 2020
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Le protocole présenté ici montre une technique pour créer un modèle de rongeur de lésions cérébrales. La méthode décrite ici utilise l’irradiation laser et cible le cortex moteur.
Transcript
Notre protocole fournit une nouvelle méthodologie pour créer des lésions cérébrales traumatiques chez les rats en utilisant l’irradiation au laser pour créer un impact de mise au point dans le cortex moteur. Le principal avantage de cette technique sont la faible variabilité dans la zone infarctus, les faibles taux de mortalité, et la simplicité relative de la procédure qui ne nécessite pas de gestionnaires experts. Dmitry Natanel, chercheur de notre laboratoire, démontrera la procédure.
Pour effectuer une lésion cérébrale induite par le laser, assignez d’abord des rats Sprague Dawley de 20 300 à 350 grammes dans le groupe laser et 20 au groupe témoin opéré par Sham. Après avoir confirmé un manque de réponse au réflexe de retrait, placez un rat sur un coussin chauffant régulé à température rectale et utilisez un rasoir pour enlever suffisamment de cheveux du site de la blessure avec une marge sans poils d’environ deux centimètres autour de l’incision. Désinfectez la peau exposée avec 70% d’éthanol et placez le rat en position couchée dans un porte-tête stéréotaxique.
Faire une incision de trois centimètres pour permettre la réflexion latérale du cuir chevelu pour exposer la zone entre bregma et lambda. Tenant un laser Nd:YAG avec longueur d’onde maximale de 1064 nanomètres à une distance de deux millimètres du crâne, administrer 50 joules fois 10 points avec une durée d’impulsion d’une seconde à la zone exposée du crâne au-dessus de l’hémisphère droit. Après la blessure au laser a été livré, enlever le rat de l’appareil et fermer le cuir chevelu avec 3-0 sutures chirurgicales de soie.
Ensuite, placez le rat dans sa cage avec surveillance jusqu’à ce que la pleine écume. 24 heures après l’intervention, utilisez un système de notation de 43 points pour évaluer le score de gravité neurologique. Tester les animaux pour les déficits neurologiques, les troubles du comportement, la tâche d’équilibrage des faisceaux, et les réflexes, et l’attribution de scores plus élevés pour les handicaps plus graves.
Après l’évaluation, récoltez le cerveau de chaque animal expérimental et de contrôle selon les protocoles standard. Pour évaluer le volume infarctus du cerveau, sectionner les cerveaux récoltés en six tranches coronale épaisses de deux millimètres et incuber chaque tranche en 0,05 % de TTC pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius. Après coloration, numérisez ces tranches à l’aide d’un scanner optique avec une résolution de 1600 points par 1600 points par pouce.
Les zones non tachées des tranches fixes du cerveau sont définies comme infarctus. Pour évaluer l’incidence de la rupture de barrière de cerveau de sang, 24 heures après que le laser a induit la charge de blessure une seringue avec le colorant bleu d’Evans de 2%Evans dilué dans quatre millilitres par kilogramme de solution saline et livre la solution par voie intraveineuse aux rats blessés et témoins par l’intermédiaire de la veine de queue cannulated. Laissez circuler la solution pendant une heure avant d’utiliser des pinces et des ciseaux chirurgicaux pour ouvrir la poitrine du premier animal.
Imprégez le cœur exposé avec 0,9% salin refroidi par le ventricule gauche à 110 millimètres de mercure de pression jusqu’à ce qu’un liquide de profusion incolore soit observé à partir de l’oreillette droite. Ensuite, récoltez le cerveau et obtenez deux tranches caudales rostrales millimétriques. Séparez les tranches gauches du cerveau des tranches droites du cerveau pour permettre l’évaluation des hémisphères blessés et non blessés séparément, et pesez les échantillons.
Homogénéiser les échantillons à l’aide d’un mortier et d’un pilon et incuber les échantillons de tissus dans 50% d’acide trichloroacetic pendant 24 heures. Le lendemain, centrifugeuse les échantillons homogénéisés de tissu cérébral pendant 20 minutes à 10 000 fois G et température ambiante, et mélanger un millilitre du supernatant avec 1,5 millilitres de 96% d’éthanol à un à trois rapports. Ensuite, utilisez un détecteur de fluorescence à une excitation de 620 nanomètres et la longueur d’onde d’émission de 680 nanomètres pour évaluer la rupture de la barrière cérébrale.
Comme l’observe l’analyse histologique, la coloration bleue Evans peut être utilisée pour révéler l’incidence des lésions cérébrales chez les animaux modèles laser et MCAO. Dans cette analyse représentative, aucun décès ou hémorragie sous-arachnoïdienne n’a été enregistré dans les groupes témoin ou expérimental, et le groupe MCAO a eu un taux de 20% de mortalité et d’hémorragie sous-arachnoïdienne. Les changements relatifs de température corporelle chez les rats des deux groupes étaient également similaires, malgré une différence dans la variabilité des deux groupes.
Les scores neurologiques de sévérité étaient sensiblement plus mauvais dans les modèles de laser et de MCAO comparés au groupe témoin sham-actionné. Les lésions cérébrales induites par laser ont également entraîné une augmentation significative du volume infarctus de l’hémisphère cible par rapport au groupe témoin opéré par Sham. Cependant, le volume infarctus du modèle laser était plus petit par rapport aux animaux blessés par la technique MCAO.
Aucune différence dans l’oedème cérébral n’a été observée entre le modèle de lésion cérébrale induite par laser et le groupe témoin opéré par Sham. Cependant, il y avait une différence significative dans l’oedème de cerveau entre le modèle de laser et les groupes blessés de MCAO. Comparé au groupe témoin sham-actionné, les dommages de cerveau laser-induits et les techniques de MCAO ont tous deux causé une augmentation significative de rupture de barrière de cerveau de sang aux hémisphères non-blessés et cibles.
Tout en essayant ce modèle, n’oubliez pas de cibler précisément la zone du cortex moteur et de normaliser l’énergie, le nombre de points irradiés, et le temps total d’exposition. Après cette procédure, une pléthore de tests comportementaux, tels que la marche des faisceaux, Froedert, et d’autres évaluations peuvent être effectuées.
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