Neuroscience
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쥐의 모터 피질에서 레이저 유도 된 뇌 손상
Chapters
Summary September 26th, 2020
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여기에 제시된 프로토콜은 뇌 손상의 설치류 모델을 만드는 기술을 보여줍니다. 여기에 설명된 방법은 레이저 조사를 사용하고 모터 피질을 대상으로 합니다.
Transcript
우리의 프로토콜은 모터 피질에 초점 충격을 만들기 위해 레이저 조사를 사용하여 쥐에 외상성 뇌 손상을 만들기위한 새로운 방법론을 제공합니다. 이 기술의 주요 장점은 경색 지역의 낮은 가변성, 낮은 사망률 및 전문가 처리기를 필요로하지 않는 절차의 상대적 단순성입니다. 절차를 보여주는 드미트리 나타넬, 우리의 실험실에서 연구원이 될 것입니다.
레이저 로 인한 뇌 손상을 수행하기 위해 먼저 20, 300 ~ 350 그램 스프라그 Dawley 쥐를 레이저 그룹에 할당하고 20을 제어 샴 작동 그룹에 할당합니다. 철수 반사에 대한 반응의 부족을 확인 한 후, 직장 온도 조절 가열 패드에 하나의 쥐를 배치하고 절개 주위에 약 2 센티미터 머리없는 마진으로 부상 부위에서 충분한 머리를 제거하기 위해 면도기를 사용합니다. 노출된 피부를 70%에탄올로 소독하고 쥐를 스테레오탁스 헤드 홀더에 놓습니다.
세 센티미터 절개를 만들어 두피의 측면 반사가 브레그와 람다 사이의 영역을 노출할 수 있도록 합니다. 두개골에서 2밀리미터 거리에서 1064 나노미터의 피크 파장을 가진 Nd:YAG 레이저를 잡고, 오른쪽 반구 위의 두개골의 노출 부위에 1초 펄스 지속 시간으로 50 줄횟수를 10점 투여합니다. 레이저 부상이 전달 된 후, 장치에서 쥐를 제거하고 3-0 실크 수술 봉합사로 두피를 닫습니다.
그런 다음 쥐를 케이지에 놓고 전체 재조정이 있을 때까지 모니터링합니다. 시술 후 24시간 후, 43점 득점 시스템을 사용하여 신경학적 심각도 점수를 평가합니다. 신경 결핍, 행동 장애, 빔 균형 작업 및 반사 신경에 대 한 동물을 테스트 하 고 더 심각한 장애에 대 한 높은 점수를 할당.
평가 후, 표준 프로토콜에 따라 각 실험 동물에서 뇌를 수확하고 제어합니다. 뇌의 경색 볼륨을 평가하기 위해 수확한 뇌를 6mm 두께의 관상 슬라이스로 섹션화하고 각 슬라이스를 섭씨 37도에서 30분 동안 0.05%TTC로 배양합니다. 염색 후 인치 해상도당 1600 점당 1600점의 광학 스캐너로 이 슬라이스를 스캔합니다.
고정 된 뇌 조각의 얼룩없는 영역은 경색으로 정의됩니다. 혈액 뇌 장벽 파손의 발생률을 평가하기 위해, 레이저 유도 된 부상 후 24 시간 식염수 용액의 킬로그램 당 4 밀리리터에서 희석 2 %에반스 블루 염료와 주사기를로드하고 캔누울 꼬리 정맥을 통해 부상 과 제어 쥐에 정맥 내 용액을 제공합니다. 수술 용 핀셋과 가위를 사용하여 첫 번째 동물의 가슴을 열기 전에 용액이 1 시간 동안 순환하도록 하십시오.
오른쪽 아트리움에서 무색 증혈액이 관찰될 때까지 110mm의 압력수은 좌심실을 통해 0.9%의 식힌 심장을 감은 심장을 퍼퓨즈한다. 다음으로, 뇌를 수확하고 2 밀리미터 장미 코골 조각을 얻을. 왼쪽 뇌 조각을 오른쪽 뇌 조각에서 분리하여 부상당한 반구와 비부상 반구를 별도로 평가하고 샘플을 계량합니다.
모르타르와 페슬을 사용하여 샘플을 균질화하고 24 시간 동안 50 % 트리클로로아세트산으로 조직 샘플을 배양합니다. 다음 날, 원심분리된 뇌 조직 샘플을 10, 000배 G 및 실온에서 20분 동안 원심분리하고, 1.5 밀리리터의 96%에탄올을 1~3비율로 혼합한다. 그런 다음 620 나노미터 의 발광 및 680 나노미터 방출 파장에서 형광 검출기를 사용하여 혈액 뇌 장벽 파손을 평가합니다.
조직학적 분석에 의해 관찰된 바와 같이, 에반스 블루 염색은 레이저 및 MCAO 모델 동물에서 뇌 손상의 발생률을 밝히는 데 사용될 수 있다. 이 대표적인 분석에서는 사망이나 지주막 출혈이 대조군 또는 실험집단에 등록되지 않았으며, MCAO 그룹은 사망률과 지주막 출혈의 20%의 비율을 가졌다. 두 그룹에서 쥐의 상대적인 체온 변화는 두 그룹의 가변성에 차이가 있음에도 불구하고 유사했습니다.
신경학적 심각도 점수는 Sham 작동 대조군에 비해 레이저 및 MCAO 모델 모두에서 훨씬 더 나빴습니다. 뇌 손상에 레이저 유도 또한 샴 작동 대조군에 비해 대상 반구에서 경색 볼륨의 상당한 증가를 발생. 그러나, 레이저 모델의 경피량은 MCAO 기술에 의해 부상된 동물에 비해 작아졌다.
뇌 부종에 차이가 레이저 유발 뇌 손상 모델과 샴 작동 대조군 사이에 관찰되지 않았다. 그러나, 레이저 모델과 MCAO 부상 그룹 사이 뇌 부종에 상당한 차이가 있었다. Sham 작동 대조군에 비해 레이저로 인한 뇌 손상 및 MCAO 기술은 모두 비부상 및 표적 반구에서 혈액 뇌 장벽 파손의 상당한 증가를 일으켰습니다.
이 모델을 시도하는 동안 모터 피질 영역을 정밀하게 타겟팅하고 에너지, 조사되는 포인트 수 및 총 박람회 시간을 표준화해야 합니다. 이 절차에 따라 빔 워킹, 프로에데르트 및 기타 평가와 같은 광범위한 행동 테스트를 수행할 수 있습니다.
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