Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Laser-inducerad hjärnskada i motor cortex av råttor
Chapters
Summary September 26th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Protokollet som presenteras här visar en teknik för att skapa en gnagare modell av hjärnskada. Den metod som beskrivs här använder laser bestrålning och mål motor cortex.
Transcript
Vårt protokoll ger en ny metod för att skapa traumatisk hjärnskada hos råttor med hjälp av laserbestrålning för att skapa en fokuspåverkan i motorbarken. Den största fördelen med denna teknik är den låga variationen i infarct område, den låga dödligheten, och den relativa enkelheten i förfarandet som inte kräver experthanterare. Demonstrerar proceduren blir Dmitry Natanel, en forskare från vårt laboratorium.
För att utföra en laser-inducerad hjärnskada, först tilldela 20, 300 till 350 gram Sprague Dawley råttor i lasergruppen och 20 till kontroll Sham-drivna gruppen. Efter att ha bekräftat en brist på svar på tillbakadragande reflex, placera en råtta på en rektal temperatur reglerad värmedyna och använda en rakapparat för att ta bort tillräckligt med hår från skadestället med en cirka två centimeter hårfri marginal runt snittet. Desinficera den exponerade huden med 70%etanol och placera råttan i utsatt position i en stereotaxisk huvudhållare.
Gör en tre centimeter snitt för att tillåta lateral reflektion av hårbotten för att exponera området mellan bregma och lambda. Hålla en Nd:YAG laser med topp våglängd på 1064 nanometer på två millimeters avstånd från skallen, administrera 50 joule gånger 10 punkter med en sekund puls varaktighet till det utsatta området av skallen ovanför den högra hjärnhalvan. Efter att laserskadan har levererats, ta bort råttan från enheten och stäng hårbotten med 3-0 siden kirurgiska suturer.
Sedan, placera råttan i sin bur med övervakning tills full recumbency. 24 timmar efter ingreppet, använd ett 43 poängsystem för att utvärdera den neurologiska svårighetsgraden poängen. Testa djuren för neurologiska underskott, beteendestörningar, strålbalanseringsuppgift och reflexer och tilldela högre poäng för svårare funktionshinder.
Efter bedömningen skördar man hjärnorna från varje försöks- och kontrolldjur enligt standardprotokoll. För att bedöma hjärnan infarct volym, avsnitt de skördade hjärnorna i sex två millimeter tjocka koronalskivor och inkubera varje skiva i 0,05%TTC i 30 minuter vid 37 grader Celsius. Efter färgning, skanna detta segment med en optisk scanner med en 1600 med 1600 punkter per tum upplösning.
De obefläckade områdena i de fasta hjärnskivorna definieras som infarcted. För att utvärdera förekomsten av brott på blodhjärnbarriären, 24 timmar efter att lasern inducerat skada ladda en spruta med 2%Evans blå färgämne utspädd i fyra milliliter per kilo saltlösning och leverera lösningen intravenöst till skadade och kontroll råttor via den kanylerade svansvenen. Låt lösningen cirkulera i en timme innan du använder kirurgiska pincets och sax för att öppna bröstet på det första djuret.
Genomsyra det exponerade hjärtat med kyld 0,9%koksaltlösning via vänster kammare vid 110 millimeter kvicksilver av tryck tills en färglös profusionsvätska observeras från höger förmak. Därefter skörda hjärnan och få två millimeter rostrala caudal skivor. Separera den vänstra hjärnan skivor från höger hjärna skivor för att möjliggöra utvärdering av de skadade och icke-skadade halvklot separat, och väga proverna.
Homogenisera proverna med hjälp av en mortel och mortelstöt och inkubera vävnadsproverna i 50%triklorättiksyra i 24 timmar. Nästa dag, centrifugera den homogeniserade hjärnvävnad prover för 20 minuter vid 10, 000 gånger G och rumstemperatur, och blanda en milliliter av supernatanten med 1,5 milliliter av 96%etanol vid ett till tre förhållande. Använd sedan en fluorescensdetektor vid en 620 nanometerexcitation och 680 nanometerutsläppsvåglängden för att bedöma blodhjärnbarriären brott.
Som observerats av histologisk analys, Evans blå färgning kan användas för att avslöja förekomsten av hjärnskada vid laser och MCAO modell djur. I denna representativa analys inga dödsfall eller subarachnoid blödningar registrerades i antingen kontroll eller experimentella grupper, och MCAO gruppen hade en 20%-frekvensen av både dödlighet och subarachnoid blödning. Den relativa kroppstemperaturen förändringar i råttorna från båda grupperna var också liknande, trots en skillnad i variabiliteten av båda grupperna.
Den neurologiska svårighetsgrad poängen var betydligt sämre i både laser och MCAO modeller jämfört med Sham-drivs kontrollgruppen. Laser-inducerad till hjärnan skada orsakade också en betydande ökning av infarct volym vid målet halvklotet jämfört med Sham-drivna kontrollgruppen. Lasermodellens infarktvolym var dock mindre jämfört med de djur som skadades av MCAO-tekniken.
Ingen skillnad i hjärnan ödem observerades mellan laser-inducerad hjärnan skada modellen och Sham-drivs kontrollgruppen. Det fanns dock en betydande skillnad i hjärnan ödem mellan laser modellen och MCAO skadade grupper. Jämfört med den Sham-drivna kontrollgruppen orsakade den laserinducerade hjärnskadan och MCAO-teknikerna båda en betydande ökning av blodhjärnbarriärens brott vid de icke-skadade och målhalvorna.
Medan du försöker denna modell, kom ihåg att exakt rikta motor cortex området och att standardisera energi, antalet punkter som bestrålas, och den totala utläggningstiden. Efter denna procedur kan en bred uppsjö av beteendetester, såsom balkvandring, Froedert och andra utvärderingar utföras.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
