Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En Neurite Outgrowth Assay og Neurotoxicity Vurdering med Human Neural Progenitor Cell-Derived Neuroner
Summary August 6th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Den fremlagte protokol beskriver en metode til en neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering af små molekyle forbindelser.
Transcript
Den præsenterede protokol, der beskriver neurite outgrowth assay, der er yderst relevant for human biologi og neurotoksicitet vurdering af et lille molekyle forbindelser. Høj translationelt potentiale og fysiologisk relevans af menneskelige neurale progenitor celler som den primære menneskelige celle model giver en betydelig fordel i neurite udvækst-relaterede lægemiddel opdagelse screening og neurotoksicitet vurdering. Ved hjælp af den præsenterede protokol kan humane inducerede pluripotente stamceller og humane embryonale stamceller afledte neuroner også anvendes som til alternative cellekilder til neurite outgrowth assay og neurotoksicitet vurdering.
Begynd med at indsamle medierne med flydende neurosfærer og overføre det til en 50 milliliter konisk rør. Centrifuge røret ved 300 til 400 gange g i tre minutter. Derefter forsigtigt aspirere supernatant.
og resuspenderede kuglerne i 500 mikroliter af optøet celle dissociation reagens. Inkuber kuglerne ved 37 grader Celsius i fem til 15 minutter. Derefter tilsættes fem til 10 milliliter forvarmte kulturmedier og centrifuge røret ved 300 til 400 gange g i fem minutter for at sedimentere neurosfærerne.
Inspirer supernatanten og tilsæt to milliliter kulturelle medier pipettering op og ned med en 1000 mikroliterpipette, indtil neurosfærerne danner en enkelt cellesuspension. Efter optælling af cellerne, tilføje to til 3 millioner celler til en T25 kolbe i 10 milliliter af kultur medier. Udskift halvdelen af kulturmediet hver tredje dag.
Brug kommercielt tilgængelige kryopræservering medium til at fryse cellerne. Overfør neurosfærerne til et 50 milliliterrør og lad kuglerne slå sig ned i bunden. Brug en 200 eller 1000 mikroliter pipettespids til at overføre de store neurosfærer til et nyt 50 milliliterrør, før de passerer.
Centrifuge de resterende neurosfærer ved 300 til 400 gange g i tre minutter og forsigtigt fjerne supernatant. Opslæm op til 1000 kugler i en milliliter kryopræserveringsregense og overfør det til et kryorør. Opbevar røret natten over på minus 80 grader Celsius, og flyt det derefter til flydende nitrogen til langtidsopbevaring.
For at måle neuronal udvækst skal du åbne billedet i Fiji og vælge Analysér, Værktøjer og ROI Manager. Højreklik på det femte ikon i værktøjslinjen Lige og skift til Frihåndslinje. Du kan også dobbeltklikke på det samme ikon for at ændre linjebredden til 10.
Derefter spore den længste neurite begynder nær cellekroppen og strækker sig til spidsen. Tryk på Control og T derefter F for at føje målingen til ROI Manager og fremhæve den målte neuron. Vælg alle tal i investeringsafkastet.
Klik på Målér, og kopiér og indsæt derefter målingerne i et regneark. Hvis du vil måle fluorescensintensiteten af markerede celler, skal du klikke på det fjerde ikon på værktøjslinjen Frihåndsmarke markeringer og tegne cellens form. Klik på Analysér og angiv målinger.
Sørg derefter for, at Område, Middelgråværdi, Min max grå værdi og Integreret tæthed er valgt. Klik på Analysér og målér. Markér området ud for cellen som baggrund.
Og klik derefter analysere og måle. Markér alle måledata, og kopiér, indsæt dem i et regneark. At pels pladen tilføje 30 mikroliter af poly-L-lysin i hver brønd af en 384-brønd plade og inkubere pladen ved stuetemperatur i en time.
Vask det to gange med PBS og lad det tørre i ca. 30 minutter. Tilføj 30 mikroliter af laminine til hver brønd, derefter inkubere pladen ved 37 grader Celsius i to timer. Gentag vaskene med PBS og fortsæt med at plating cellerne.
Tilføj 20,000 encellede neurosfærer i 25 mikroliter af differentieringsmedier til hver brønd af 384-brøndpladen og inkuber pladen ved 37 grader Celsius i fem dage. Hight precision pipettering færdigheder er nødvendige for plating det nøjagtige antal neurosfærer, der er alle adskilt i enkelte celler. Derfor anbefales det at differentiere neurosfærerne til neuroner før plating for at opnå mere reproducerbare resultater.
Efter inkubationen tilsættes fem mikroliter testforbindelse til hver brønd ved seks gange den ønskede koncentration. Og inkuber cellerne i yderligere 24 timer. For at udføre cellens levedygtighed essay, tilføje 30 mikroliter af selvlysende reagens til hver brønd.
Og lad pladen være på en shaker i to minutter. Centrifuge pladen ved 300 til 400 gange g i 30 sekunder, derefter inkubere pladen ved stuetemperatur i 10 minutter, beskytte den mod lys. Efter inkubationen måles luminescensen på en mikropladelæser.
De humane neurale progenitor celle-afledte neuroner blev brugt til at undersøge effekten af HDAC-hæmmere som små molekyle epigene forbindelser til udvidelse af neurites og efterfølgende neurogene evne til små molekyleforbindelser. HDAC-hæmmernes neurotoksicitet blev også vurderet efter at have differentieret de neurale progenitorceller i 384-brøndsplader, hvilket viste muligheden for at skalere protokollen for et højere antal forbindelser. I en anden undersøgelse blev måling af den neuronale cellefluorescensintensitet anvendt til at kvantificere forekomsten af histon H4-lysin fem acetylation som en histonmarkør efter behandling af neuronerne med epigenetiske modifikatorforbindelser.
Derudover, denne protokol er blevet brugt til at visualisere en præ-synaptisk protein, synaptophysin, at kontrollere for mulige synaptogeniske virkninger af små molekyle forbindelser. Ved hjælp af den præsenterede metode kan neurites tal, intensitet, længde og bredde sammen med synaptiske egenskaber, herunder præ- og postsynaptiske proteinmodifikationer, måles pålideligt.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE