Developmental Biology
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神经石生长分析与神经毒性评估与人类神经原生细胞衍生神经元
Summary August 6th, 2020
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提出的方案描述了一种小分子化合物的神经质生长测定和神经毒性评估方法。
Transcript
提出的描述神经土生长分析的协议，与人类生物学和小分子化合物的神经毒性评估高度相关。作为人类主要细胞模型，人类神经祖细胞具有很高的转化潜力和生理相关性，在神经素生长相关的药物发现筛选和神经毒性评估方面具有相当大的优势。利用所提出的方案，人类诱导多能干细胞和人类胚胎干细胞衍生神经元也可用于神经素生长测定和神经毒性评估的替代细胞来源。
首先收集带浮动神经球的介质，然后将其转移到50毫升锥形管中。将管子在300至400次g下离心3分钟。然后小心吸上一道。
并在500微升解冻细胞分离试剂中重新分配球体。在37摄氏度下孵育球体5至15分钟。然后加入5至10毫升预热培养培养剂，将管以300至400倍g离心5分钟，沉淀神经球。
吸升液，并添加两毫升的文化介质移液上下与1000微升移液器，直到神经球形成一个单细胞悬浮。计数细胞后，在10毫升培养培养的T25烧瓶中加入200万到300万个细胞。每三天更换一半的文化媒体。
使用市售的低温保存介质冷冻细胞。将神经球转移到50毫升管，让球体在底部稳定下来。使用 200 或 1000 微升移液器尖端在通过前将大神经球转移到新的 50 毫升管中。
将剩余的神经球在300至400次g下离心三分钟，并小心地取出上一代。在一毫升低温保存试剂中重新分配到一千个球体，并转移到低温管中。将管子在零下80摄氏度下过夜，然后将其移至液氮中进行长期储存。
要测量神经元生长，请在斐济打开图像并选择"分析、工具和 ROI 管理器"。右键单击工具栏"直线"中的第五个图标，然后切换到"手绘线"。可选地，双击同一图标可将线宽更改为 10。
然后追踪细胞体附近最长的神经石，并延伸到尖端。按"控制"和"T"然后按 F 将测量值添加到 ROI 管理器中，并突出显示测量的神经元。选择 ROI 中的所有数字。
单击"测量"，然后将测量值复制并粘贴到电子表格中。要测量标记单元格的荧光强度，请单击工具栏"手绘选择"中的第四个图标并绘制单元格的形状。单击"分析和设置测量"。
然后确保选择"面积"、"平均灰色"值、最小最大灰值和集成密度。单击"分析和测量"。选择单元格旁边的区域作为背景。
然后单击分析和测量。选择所有测量数据并复制，将其粘贴到电子表格中。将板涂覆，将30微升聚L-lysine加入384井板的每个井中，并在室温下孵育板一小时。
用 PBS 清洗两次，让它干燥约 30 分钟。在每个井中加入30微升层压，然后在37摄氏度下孵育板两小时。使用 PBS 重复洗涤，然后继续电镀电池。
在384井板的每个井中加入25个微升的25个单细胞神经球，并在37摄氏度下孵育5天。需要高精度移液技能来电镀所有隔离到单个细胞的神经球的确切数量。因此，建议在电镀前将神经球区分为神经元，以达到更可重复的结果。
孵育后，在每井中加入5微升试验化合物，浓度是所需浓度的六倍。再孵育24小时要执行细胞生存能力短文，请在每个井中加入30微升的发光试剂。
将盘子放在摇床上两分钟。在300至400次g下离心30秒，然后在室温下孵育板10分钟，防止其受到光线的污染。孵育后，测量微孔板读卡器上的发光。
人类神经祖细胞衍生神经元用于研究HDAC抑制剂作为小分子致生化合物对小分子化合物的延伸和小分子化合物随后的神经生成能力的作用。HDAC抑制剂的神经毒性在区分384孔板中的神经祖细胞后也进行了评估，显示出为数量增加的化合物扩展协议的潜力。在另外一项研究中，使用神经细胞荧光强度的测量方法，在用表观遗传修饰剂化合物处理神经元后，将组蛋白H4 lysine五个乙酰化作为组蛋白标记的丰度进行量化。
此外，该协议已用于可视化突触前蛋白，突触物理，以检查小分子化合物可能的突触效应。使用介绍的方法，可以可靠地测量中性数、强度、长度和宽度，以及突触特征，包括突触前和突触后蛋白质修饰。
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