9,100 Views
•
11:36 min
•
November 14, 2020
DOI:
Ischemisk stroke är ett kliniskt tillstånd som kännetecknas av hypoperfusion av hjärnvävnad och resulterar i neuronal förlust. Ett flertal belägg tyder på att samspelet mellan glia och urinalceller utövar tryckeffekterna efter en ischemisk händelse. För att utforska potentiella skyddsmekanismer, Det är viktigt att utveckla modeller som gör det möjligt att studera neuron-glia interaktioner i en ischemisk miljö.
Här presenterar vi ett enkelt tillvägagångssätt för att isolera astrocyter och nervceller från råtta embryonala cortex, och att genom att använda specifika kulturella medium tillåter inrättandet av neuron eller astrocyte-berikade kulturer eller neo-glia kulturer med hög avkastning och reproducerbarhet. För att studera överhörning mellan astrocyter och nervceller föreslår vi ett tillvägagångssätt, baserat på ett samkultursystem, där nervceller odlade i täckslirningar upprätthålls i kontakt med en monolayer av astrocyter pläterade i fler-brunnsplattor. De två kulturerna underhålls en del av små paraffinsfärer.
Detta tillvägagångssätt möjliggör oberoende manipulation och tillämpningen av specifik behandling på varje celltyp, vilket utgör en fördel i många studier. För att simulera vad som sker under en ischemisk stroke utsätts kulturerna för ett protokoll för syre- och glukosbrist. Detta protokoll representerar ett användbart verktyg för att studera rollen av neuron-glia interaktioner i ischemisk stroke.
Börja med råtta embryonala cortex isolering. Embryona erhölls från en familj av råttor vid 15 dagars dräktighet och placeras i ett sterilt Falcon-rör som innehåller PBS. Fortfarande inuti äggulan påse embryon placeras inuti en petriskål som innehåller kalla PBS.
Med hjälp av sax och pincett bryts gulesäcken, och embryot avlägsnas och placeras i en annan petriskål som innehåller kall PBS över en isförpackning. Det är nödvändigt att vara mycket försiktig när man bryter gulesäcken att inte skada embryot. Placera embryot under ett dissekerande mikroskop, försiktigt fixa embryot med hjälp av en twizzer.
Det initiala snittet bör vara parallellt med cortex. Var försiktig så att djuret inte halshuggs. Hårbotten och avlägsnas försiktigt inte för att skada den kortikala hjärnvävnaden.
Nästa snitt skiljer cortex. Ta bort de blodkärl som finns i vävnaden. Slutligen, med hjälp av en pipett, överföra kortikala vävnaden till en Falcon rör med PBS.
Den enda cell suspension erhålls genom mekanisk rötning av den kortikala hjärnvävnaden med hjälp av tips med minskande diameter. Se till att vävnaden är väl homogeniserad Efter rötningen centrifugera materialet vid 400 Gs i tre minuter. Kassera supernatanten och återanvänd sedimentet i odlingsmedium, värms tidigare till 37 grader.
Beräkna det totala antalet celler som förekommer i suspensionen med hjälp av en Neubauerkammare och bereder utspädningen för den adekvata celltätheten. Slutligen, utsäde cellerna i multi-well och inkubera i 37 grader. För att förbereda materialet för samkultursystemet, värm paraffin i ett värmeblock tills det blir flytande.
Sedan, med hjälp av ett stereoglas Pasteur pipetten förbereda små sfärer över locket glider som tidigare placerades i en multi-well, och belagda med Poly-D-Lysine. 24 timmar, för de två kulturerna kommas med i kontakt, ändring kulturmedel av nervceller och astrocytes att komplettera det NBM med eller utan värme inaktiverade FBS. När de två kulturerna är redo att använda, överföra neuron, sittande i locket glider med paraffin sfärer till brunnar som innehåller astrocyter med hjälp av en pincett tidigare nedsänkt i 70%etanol.
Efter att ha placerat båda celltyperna i kontakt, vänta åtta till 12 timmar och sedan starta de olika stimuli och förfaranden. Syret och glukosbristen utförs i en kultur med sju dagars tillväxt. Ta bort odlingsmediet, och tvätta cellerna två gånger med HBSS-medium utan glukostillskott.
Var säker på att allt medium som innehåller glukos tvättas. Försegla Hypoxikammaren och tillsätt gasmixen som innehåller 95%kväve och 5%koldioxid i fyra minuter med ett flöde på 20 liter i minuter för att ersätta syret som finns inne i kammaren. Sedan, stoppa flödet och placera Hypoxikammaren i en inkubator på 37 grader.
Efter perioden av syre och glukos deprivation, ersätta mediet, HBSS utan glukos tillskott med lämplig odlingsmedium för de återstående förfarandena och inkubera cellerna på 37 grader. För att karakterisera typ av när kultur, utförde vi immunohistokemi i de tre typerna av när kulturer för att bedöma antalet celler som uttryckt GFPA eller MAP2, som är markörer som används allmänt för astrocytic och neuronal celler respektive. Dessa analyser visade att när detta protokoll, kunde vi få en ren berikad kultur av astrocyter med cirka 97%av cellerna uttrycker GFAP.
Angående den neuron-berikade kulturen verifierade vi cirka 78%av cellerna som uttrycker MAP2. Men vi identifierar cirka 18%av GFAP och MAP2 negativa celler. För den neuron-glia kortikala kulturen, Det observerades att cirka 49%av cellerna är MAP2 positiva.
31%är GFAP positiva. Och 20% de är inte ansvariga för GFAP eller MAP2. Sju dagar efter den kortikala kulturen etablering, neuron-glia kultur och neuron-berikade kulturen utsattes för en OGD förfarande för 4 och 6 timmar.
Efter detta förfarande var celler märkt med MAP2 och sedan antalet MAP2 positiva celler kvantifierades med hjälp av fluorescens mikroskopi. I neuron-glia kultur, Det observerades en minskning av cirka 30%i antalet av de nervceller, när kulturen lämnades till en OGD period av 4 timmar. Efter en OGD period av 6 timmar, förlängningen av lesion ökar, nå omkring 60%av neuronal förlust.
Angående den berikade kulturen av nervceller som exponerats för OGD, observerades det om 41%och 64%minskning av antalet MAP2 celler. Dessutom observerades att i den neuron-berikade kulturen, det fanns en liten ökning av skadan förlängningen när jämfört med neuron-glia kultur också utsätts för OGD under 4 timmar. Sammanfattningsvis, här representerar en in vitro-modell för att studera ischemisk stroke etablerade i en enkel, snabb och dyr och reproducerbart sätt.
Dessutom, den beskrivna metoden gör det också möjligt att genomföra nervceller och astrocyter-berikade primära kulturer, men också en neuron-glia kultur. Således, ger en stor in-vitro-modell för modellering flera hjärnsjukdomar med en högre nivå av komplexitet, än förevigade cellinjer och ren neuronala eller gliakulturer kulturer.
Här presenterar vi ett enkelt tillvägagångssätt med hjälp av specifika kulturmedier som möjliggör inrättandet av neuron- och astrocyter-berikade kulturer, eller neuron-glia kulturer från den embryonala cortex, med hög avkastning och reproducerbarhet.
Read Article
Cite this Article
Gava-Junior, G., Roque, C., Mendes-Oliveira, J., Bernardino, A. C., Serrenho, I., Pires, J. P., Baltazar, G. A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia. J. Vis. Exp. (165), e61388, doi:10.3791/61388 (2020).
Copy