Biology
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पौधों में स्थानिक और लौकिक ऊतक-विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन आरएनए-अनुक्रमण
Chapters
Summary August 5th, 2020
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यहां प्रस्तुत पौधों के ऊतकों के लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन (एलसीएम) के लिए एक प्रोटोकॉल है। एलसीएम ऊतक के क्षेत्रों को संदूषण मुक्त तरीके से अलग करने के लिए एक सूक्ष्म तकनीक है। प्रक्रिया में ऊतक निर्धारण, पैराफिन एम्बेडिंग, सेक्शनिंग, एलसीएम और आरएनए निष्कर्षण शामिल हैं। आरएनए का उपयोग डाउनस्ट्रीम ऊतक-विशिष्ट, ट्रांसक्रिप्टोम के अस्थायी रूप से हल किए गए विश्लेषण में किया जाता है।
Transcript
यह प्रोटोकॉल कम मात्रा में जैविक सामग्रियों का उपयोग करके हितों के पौधों में विशिष्ट कोशिकाओं से स्थानिक और अस्थायी ट्रांसक्रिप्टोम प्राप्त करने के लिए आरएनए-अनुक्रमण के साथ मिलकर लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन का उपयोग करता है। लेजर तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह सामान्य ऊतक संदर्भ के भीतर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष दृश्य की सुविधा प्रदान करता है, जिससे असतत कोशिकाओं को संपर्क मुक्त तरीके से ठीक से अलग किया जा सकता है। यद्यपि यह प्रोटोकॉल पौधों की कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुकूलित है, इसे अधिकांश कोशिकाओं पर लागू किया जा सकता है जिन्हें स्टॉइलॉजिकल रूप से पहचाना जा सकता है।
अच्छा नमूना तैयारी महत्वपूर्ण है। इसलिए, पहली बार इस तकनीक का प्रदर्शन करने वाला, लेजर-कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन से पहले ऊतक निर्धारण और एम्बेडिंग का प्रोप अनुकूलन महत्वपूर्ण है। ऊतक नमूना इकट्ठा करने से पहले, प्रजातियों और ऊतक प्रकार के लिए उपयुक्त एक फिक्सेटिव तैयार करने के लिए काटा जा सकता है ।
जौ के बीज के लिए, बर्फ ठंड फिक्सेटिव की कम से कम एक 10 X मात्रा में नमूनों को जलमग्न करने से पहले आधे में बीज के नमूनों में कटौती। फिक्सेटिव के प्रवेश में तेजी लाने के लिए वैक्यूम घुसपैठ का उपयोग करें। ऊतक घुसपैठ के अंत तक डूब जाना चाहिए, फिर रात भर इनक्यूबेशन के लिए फिक्सेटिव को ताज़ा करें और नमूनों को ऊतक प्रसंस्करण के लिए कैसेट में स्थानांतरित करें।
ऊतक भरी हुई कैसेट को स्वचालित प्रोसेसर की धातु की टोकरी में रखें और धातु की टोकरी को कक्ष एक के ऊपर अपने धारक को संलग्न करें। ऊतक प्रोसेसर के नियंत्रण पैनलों पर कार्यक्रम सेट करें और स्वचालित प्रसंस्करण कार्यक्रम शुरू करने के लिए प्रेस शुरू करें। यह प्रणाली कैसेट को ९० मिनट प्रति एकाग्रता के लिए इथेनॉल की ढाल श्रृंखला में डुबोकर नमूनों को निर्जलित करेगी जैसा कि संकेत दिया गया है ।
अंतिम इथेनॉल विसर्जन के बाद, सिस्टम संकेत के अनुसार 90 मिनट तक जाइलीन ग्रेडिएंट्स में नमूनों को जलमग्न कर देगा। इसके बाद पिघले हुए पैराफिन में 55 से 60 डिग्री सेल्सियस पर 290 मिनट का विसर्जन किया गया। अगली सुबह, ऊतक प्रोसेसर से पैराफिन घुसपैठ कैसेट निकालें और पैराफिन एम्बेडिंग के लिए आगे बढ़ें।
अगली सुबह, प्रक्रिया के नमूनों को उपयुक्त आकार के मोल्डों में स्थानांतरित करने और प्रत्येक नमूने पर पिघला हुआ पैराफिन जोड़ने के लिए ठीक संदंश का उपयोग करें। जौ के बीजों के लिए, देशांतर में पैराफिन में नमूनों को काटने की दिशा में उन्मुख करें ताकि देशांतर खंडों के अधिग्रहण को सुविधाजनक बनाया जा सके। मोल्ड पर एक साफ कैसेट रखें और यह सुनिश्चित करें कि पूरी कैसेट पूरी तरह से कैसेट के लिए नमूना सुरक्षित करने के लिए पैराफिन की एक पर्याप्त मात्रा के साथ कवर किया जाता है ।
फिर मोल्ड से ब्लॉक जारी करने से पहले पैराफिन सेट होने तक मोल्ड को 10 से 20 मिनट के लिए ठंडी प्लेट पर रखें। पेन झिल्ली स्लाइड तैयार करने के लिए, तीन सेकंड के लिए आरएनएस निष्क्रिय समाधान में स्लाइड जलमग्न दो संक्षिप्त वॉश और DEPC उपचारित पानी के बाद । फिर स्लाइड्स को 370 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में ड्राइव करें ताकि किसी भी बचे हुए समाधान को हटाया जा सके और यूवी स्लाइड्स को 30 मिनट के लिए लेमिनार फ्लो कैबिनेट में ट्रीट करें ताकि उनके पैराफिन को हेजलनट्स न बढ़ाया जा सके।
एक नमूना ऊतक खंडित करने के लिए ठंड की थाली पर पैराफिन ब्लॉक रखें और डीईपीसी उपचारित पानी के साथ पानी स्नान भरें, फिर 42 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करें। ब्याज के क्षेत्र की गहराई तक ब्लॉक करें और पैराफिन ब्लॉक को छह से 10 माइक्रोन मोटाई तक सेक्शन करें। एक अच्छी तरह से खंडित ब्लॉक ब्लेड के किनारे पर एक रिबन बनाएगा।
धीरे-धीरे पानी स्नान करने के लिए माइक्रोटॉम से रिबन स्थानांतरित करने के लिए एक ठीक चिमटी का उपयोग करें, ध्यान रखते हुए कि रिबन पानी की सतह पर सपाट देता है। वर्गों को इकट्ठा करने के लिए, एक ४५ डिग्री कोण पर एक स्लाइड पकड़े, स्लाइड पर पानी से बाहर एक रिबन उठाने के लिए एक ऊपर की गति का उपयोग करें और ध्यान से अतिरिक्त पानी को हटाने के लिए एक लिंट मुक्त ऊतक का उपयोग करें । जब सभी वर्गों को एकत्र किया गया है, तो जाइलीन में 320 सेकंड वॉश के साथ स्लाइड धोएं और इसके बाद 100% इथेनॉल में 230 सेकंड वॉश और 70% इथेनॉल में 230 सेकंड वॉश करें।
डिपार्राफिनाइज्ड और ड्राई टिश्यू सेक्शन से ब्याज की कोशिकाओं को माइक्रोडिसेक्ट करने के लिए, उपलब्ध स्लॉट में तीन एलसीएम माइक्रोस्कोप स्लॉट और लोड कलेक्शन ट्यूब पर स्लाइड लोड करें। नमूने के उस क्षेत्र का पता लगाने के लिए चरण को स्थानांतरित करें जिसे काटने और झिल्ली स्लाइड पर ऊतक से मुक्त एक खाली खंड को काटने की आवश्यकता है। काटने की गति और लेजर दबाव ऊर्जा और ध्यान पहुंचाने में काटने का अनुकूलन करने के लिए।
ऊतक में रुचि के क्षेत्र को रेखांकित करने के लिए ड्राइंग टूल का उपयोग करें और चिपकने वाली टोपियों में कोशिकाओं को गुलेल करने के लिए अनुकूलित मापदंडों और रोबो एलपीसी फ़ंक्शन का उपयोग करें। ब्याज के क्षेत्रों को चिह्नित करने के लिए ध्वज उपकरण का उपयोग करने के लिए तत्वों की सूची से ध्वज का चयन करें। चिपकने वाली टोपी का निरीक्षण करने के लिए कैप चेक बटन की जांच करें, पुष्टि करने के लिए कि नमूनों को पकड़ लिया गया है ।
आमतौर पर आरएनए निष्कर्षण के लिए प्रति कैप 10 से 15 वर्गों की आवश्यकता होती है। सभी नमूनों का अधिग्रहण किए जाने के तुरंत बाद, आरएनए क्षरण से बचने के लिए आरएनए निष्कर्षण के लिए तुरंत आगे बढ़ें। आरएनए निष्कर्षण और आरएनए प्रवर्धन के बाद एक स्वचालित इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रणाली का उपयोग करें, निर्माता के निर्देशों के अनुसार, एंटीसेंस आरएनए की मात्रा और अर्हता प्राप्त करने के लिए।
इस अध्ययन में, एलसीएम, आरएनए-अनुक्रमण को अंकुरण के दौरान ४८ घंटे के समय के पाठ्यक्रम पर हर आठ घंटे में तीन भ्रूण अंगों से कोशिकाओं की एक छोटी संख्या के लिए लागू किया गया था । चयनित क्षेत्र के किनारे को जलाए बिना आसपास के ऊतकों से ब्याज के ऊतकों को ठीक से काटने और उखाड़ फेंकने की अनुमति देने के लिए काटने के मापदंडों को सही ढंग से समायोजित करना महत्वपूर्ण है। आरएनए प्रवर्धन से पहले कुल आरएनए का असर अच्छी गुणवत्ता वाले आरएनए नमूनों में 18 और 28S रिबोसोमल सबयूनिट के अलग इलेक्ट्रोफोरेटिक बैंड और फ्लोरोसेंट चोटियों का पता लगाने की अनुमति देता है।
सफलतापूर्वक संश्लेषित एंटीसेंस आरएनए प्रवर्धन के दो दौर के बाद 300 न्यूक्लियोटाइड के आसपास एक चोटी के साथ 100 से 1000 न्यूक्लियोटाइड के साथ एक यूनिमोडल सममित आकार वितरण प्रदर्शित करेगा। अंकुरण के 48 घंटे से अधिक विभिन्न ऊतकों में व्यक्त जीन के बहुआयामी पैमाने की साजिश रचने, एक ही समय बिंदु से नमूनों के बीच की तुलना में एक ही ऊतक के नमूनों के बीच एक बड़ी समानता दिखाता है, लेकिन विभिन्न ऊतकों। ऊतक के शून्य घंटे के समय बिंदु के सापेक्ष प्रत्येक ऊतक में अंकुरण के दौरान अंतर व्यक्त जीन की संख्या उत्तरोत्तर बढ़ जाती है।
इस प्रतिनिधि विश्लेषण में, प्लंयूल का 25%, रेडिकल का 34%और 41% स्कूटी डिफरेंशियल रूप से व्यक्त किए गए जीन प्रत्येक ऊतक के भीतर विशेष रूप से व्यक्त किए गए पाए गए। चयनित क्षेत्र के किनारे को जलाए बिना आसपास के ऊतकों से चयनकर्ता क्षेत्र के सटीक एक्सिशन और डिफोट्टिंग के लिए काटने के मापदंडों को सही ढंग से समायोजित करना महत्वपूर्ण है। बेहतर क्रोमेटिन और प्रोटीन शुद्धिकरण विधियों के साथ, और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री उपकरण को बढ़ाने के लिए, एलसीएम का उपयोग सेल प्रकार विशिष्ट एपिजेनोमिक और प्रोटेओमिक्स अध्ययन प्रत्यारोपण के लिए किया जा सकता है।
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