Genetics
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Ein Ansatz zur Untersuchung formabhängiger Transkriptomik auf einer Ebene einer einzelzelligen Ebene
Chapters
Summary November 2nd, 2020
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Dieses Papier stellt Methoden für den Anbau von Herzmyozyten mit verschiedenen Formen, die verschiedene Pathologien darstellen, und das Sortieren dieser anhaftenden Herzmyozyten basierend auf ihrer Morphologie auf einer einzelnen Zellebene. Die vorgeschlagene Plattform bietet einen neuartigen Ansatz für hohe Durchsatz- und Arzneimittelscreenings für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
Transcript
Wir schlagen eine neuartige Plattform zur Untersuchung der Auswirkungen der Zellform auf die Genexpression vor, indem Methoden zum Anbau und Sortieren von Aufhaltungen mit verschiedenen Morphologien auf Einzelzellebene verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie die Untersuchung der Zellform in vitro mit hohem Durchsatz erleichtert, da der Vergleich von Zellen mit verschiedenen Formen in vivo technisch anspruchsvoll ist. Um eine gemusterte Kardiomyozytenkultur einzurichten, übertragen Sie eine Kardiomyozytensuspension im Seitenverhältnis von Interesse auf eine 15-Milliliter-Röhre zum Zählen und verdünnen Sie die Zellen auf ein mal 10 bis zu den fünf Zellen pro Milliliter geeigneter Beschichtungsmediumkonzentration.
Fügen Sie zwei Milliliter Zellen auf einen fibronectin beschichteten mikrogemusterten Chip in zwei Milliliter warmes Beschichtungsmedium in einer 35 Milliliter Grenier Petrischale und legen Sie die Schale in einem 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid-Inkubator für 18 Stunden. Überprüfen Sie am nächsten Tag den Chip mit lichtmikroskopischer Mikroskopie, um zu bestätigen, dass die meisten Zellen angebracht sind. Entfernen Sie das Medium aus der Schale, um Schmutz und abgestorbene Zellen zu entfernen, und beginnend von der Mitte und in Richtung der Seiten in einer tropfenweise Weise, sanft HINZUFÜGEN PBS zu den Zellen.
Nach der dritten Wäsche das PBS durch ein Vier-Milliliter-Wartungsmedium ersetzen und die Zellen in den Zellkultur-Inkubator zurückbringen. Nach 72 Stunden die Spanoberfläche zwei Mal vorsichtig mit zwei Millilitern warmer Dulbecco-PBS pro Waschgang spülen und den gewaschenen Chip sofort auf eine neue sterile 35 Milliliter Grenier Petri Schale übertragen. Fügen Sie schnell 1,5 Mikroliter lebendiges Dicycle Grün verdünnt 1000-fach in DPBS auf den Chip.
Befestigen Sie eine Kammer über dem Chip und legen Sie die Schale auf den Tellerhalter der Zelle Picker-Bühne. Setzen Sie die Magnetkappe ein und suchen Sie das Fadenkreuz im Live-Ansichtsfenster. Konzentrieren Sie sich auf das Fadenkreuz und wählen Sie im Scan- und Sortierfenster die Kalibrierung für die automatisierte Injektion und Kalibrierung aus.
Ersetzen Sie den Tellerüberstand durch 1,5 Milliliter eines 1:1-Triple-E in DPBS-Lösung, um die Zellen aus dem Fibronectin zu lösen und die Scan-Registerkarte zu öffnen. Um den gesamten Chip zu scannen, konzentrieren Sie sich auf die obere linke Ecke des Chips im Sichtfeld und klicken Sie auf aktuelle Mikroskopposition. Als nächstes konzentrieren Sie sich auf die untere rechte Ecke des Chips und klicken Sie auf aktuelle Mikroskopposition.
Klicken Sie im Popup-Fenster auf Schärfste auf festlegen, und klicken Sie auf Rechts oben und gehen Sie zu den linken oberen Schaltflächen. Klicken Sie dann auf Fertig stellen, um mit dem Scannen zu beginnen. Wenn der Scanvorgang abgeschlossen ist, öffnen Sie die Registerkarte Analysieren, und klicken Sie auf Karte anzeigen, um die einzelnen Zellen auszuwählen, die die Studienkriterien bestehen.
Zentrieren Sie die Glasmikrokapillare in der Mitte des Mikroskops Live-Ansicht und öffnen Sie die Pumpe Lasche. Um ein Vakuum zu erzeugen, ziehen Sie den Kolben von einer 50 Milliliter Spritze Nummer eins vier Milliliter ein und öffnen Sie die Sortierlasche. Um die Kommissionierung einer einzelnen Zelle zu ermöglichen, stellen Sie das Ventil zwei für 120 Millisekunden und das Ventil 1 für 20 Millisekunden nach einem Zeitraffer von 200 Millisekunden ein.
Damit die entnommene Zelle erfolgreich in ihren PCR-Rohr mit Lysepuffer geliefert werden kann, stellen Sie das Ventil 1 für 20 Millisekunden und das Ventil zwei für 10 Millisekunden nach einem Zeitraffer von 10 Millisekunden ein. Wenn die Ventileinstellungen angepasst wurden, klicken Sie auf Pfad berechnen. Die Software berechnet den schnellsten Pfad von Zelle zu Zelle für die Aufnahme und Injektion der ausgewählten Zellen im gesamten Chip.
Konzentrieren Sie das Mikroskop dann auf ein Muster auf der Spanoberfläche. Verwenden Sie den Joystick, um die Mikrokapillare vorsichtig nach unten zu bewegen, so dass das schärfste Bild der Spitze der Mikrokapillare erhalten werden kann, ohne die Spanoberfläche zu berühren und auf Set zu klicken. Es öffnet sich ein neues Fenster, das den Mikrokapillarquerschnitt zeigt.
Um die Software den Spitzenversatz der Kapillare in den X-, Y- und Z-Koordinaten aufzeichnen zu lassen, klicken Sie auf die genaue Mitte der Kapillare. Klicken Sie dann auf Sortieren starten, um die Sortierung zu starten. Bei dieser repräsentativen Analyse der vorverstärkten cDNA aus einer entnommenen Einzelzelle wurde ein klares Band im Gel wie densitometry-Plot beobachtet, das dem Peak bei 1, 852 Basenpaaren im Elektropherogramm entspricht.
Die durchschnittliche Größe der Fragmente betrug 1, 588 Basenpaare mit einer kleinen Anzahl von Fragmenten, die kürzer als 300 Basenpaare waren, was auf die Generierung einer guten cDNA-Bibliothek hinweist. Immunfluoreszierende Färbung und Analyse können auch durchgeführt werden, um die Sarkome-Struktur innerhalb der gemusterten Kardiomyozyten zu bewerten. Diese Plattform ebnet den Weg für Hochdurchsatzstudien und Arzneimittelscreenings für verschiedene Arten von Herzinsuffizienz.
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