Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Mucociliary Epithelial Organoids fra Xenopus embryonale celler: Generation, Kultur og høj opløsning Live Imaging
Chapters
Summary July 28th, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en simpel protokol til at udvikle mucociliære epitelorganoider fra dybe ectoderm celler isoleret fra Xenopus laevis embryoner. De multipotente forfædre regenererer epitelcelleprækursorer og tillader direkte sporing af initieringen og progressionen af celleovergangene på overfladen af organoider.
Transcript
Mucociliary epitel linjer indre organer i vores krop og giver den første linje i forsvaret ved at rydde fremmede partikler. Denne protokol gør det muligt at generere embryonale celler afledt mucociliary epitel organoid i 24 timer. Den vigtigste fordel ved vores metode er, at vi kan overvåge den levende progression af celleovergange på overfladen af organoider.
Denne reproducerbare, skalerbare, og hurtig protokol for udvikling organoid vil give forskerne mulighed for at behandle grundlæggende spørgsmål for biologi mucociliary epitel. Til at begynde, opnå X.Laevis embryoner ved manuelt at indsamle æg fra stimuleret kvindelige frøer og udføre in vitro befrugtning. De-gelé de befrugtede embryoner med blid omrøring i 2% Cystein, i en tredjedel X-modificeret Barth's saltvand i cirka fem minutter.
Embryo embryonerne dyrkes i en tredjedel XMBS ved den foretrukne temperatur, indtil de første tegn på trin 10 opdages, såsom fremkomsten af mørke pigmenterede celler omkring blastopore ved vegetal visning. Vælg og saml embryoner, når de når tidligt fase 10 ved hjælp af hår værktøjer under et stereoscope. De udvalgte embryoner overføres til en DFA-fyldt petriskål med engangsoverførselspipette.
Fjern derefter vitellinemembranen af embryonerne ved hjælp af skarpe snævn fra den vegetabilske side, uden at forstyrre fosterets dyreside. For at isolere dyrehætten skal du placere fosterets dyreside op. Visuelt anslå omfanget af dyret cap, der skal fjernes, og gøre det første snit langs kanten med en hårkniv, trække kniven udad for at gøre snittet.
Gentag denne proces for at skabe en kæde af små nedskæringer til punktafgifter dyret cap. Trim den tyk-lagne kant af dyret hætte ved hjælp af en hårkniv for at forhindre optagelse af mesoderm prækursorer. For at adskille dybe ectoderm celler fra dyret hætte, overføre de punkterede dyr hætter til en petriskål fyldt med calcium og magnesium-fri DFA med en engangsoverførsel pipette.
Placer dyret hætter til ansigt dyr side op, opretholde en generøs afstand fra andre explants. Vent i fem til ti minutter, og derefter overvåge explants under et stereoscope. Når de løsnede dybe celler er blevet frigivet fra kanten af det mørkpigmenterede overfladiske lag, begynde at løfte det overfladiske lag væk fra de lyse dybe ectoderm celler.
Fjern forsigtigt det overfladiske lag med en hårkniv, der starter ved kanten. Derefter indsamles de dybe ectoderm celler med så lidt calcium og magnesium-fri DFA som muligt. Overfør indsamlede dybe ectoderm celler til ikke-klæbende PCR rør, der indeholder 200 mikroliter DFA og forsigtigt pipette medierne to til tre gange for at sprede de overførte celler.
Luk rørene og hold dem oprejst for at fremkalde spontan sammenlægning i bunden. Overvåg sammenlægningsprocessen under et stereomikroskop. Celler samles typisk i bunden af PCR-røret inden for en time og samles i sfæriske aggregater inden for to til tre timer afhængigt af størrelsen.
At udføre levende billeddannelse eller drug test under udviklingen af mucociliary epitel organoids, indsamle aggregater på to timer efter sammenlægning ved hjælp af en 200 mikroliter pipette udstyret med forstørrede spidser. At tillade aggregater at udvikle sig til mucociliary epitelorganoider i kultur, indsamle dem fra PCR rør på fem timer efter sammenlægning og overføre dem til en DFA-fyldt Petriskål. Placer aggregaterne langt fra hinanden for at forhindre sammensmeltning.
Inden for 24 timer af kultur ved stuetemperatur, uden nogen ekstra faktorer, modne mucociliary epitelorganoider kan observeres roterende på grund af slå cilier, der dækker overfladen af den differentierede epitel. Forbered et glasbundet billeddannelseskammer ved at lime et dækglas til et brugerdefineret sleben akrylkammer med siliciumfedt, tæt forsegling af kammeret for at forhindre lækage af kulturmediet, og fyld derefter billedkammeret med DFA. Saml en sekskantet transmission elektronmikroskopi eller TEM gitter ved hjælp af kraftbefængte og anvende en lille mængde fedt til kanten af nettet.
Tryk let ned for at fastgøre TEM-gitteret til bunden af billedkammeret. Overfør aggregaterne til billedkammeret, og placer dem i gitteret. Fyld kammeret med DFA og forsegle det med et dækglas og fedt.
For at følge udviklingen af mucociliary epitel organoid dannelse, indsamle tid-lapsed z-stack billeder af aggregater ved hjælp af en konfokal mikroskop. Mucociliary epitelorganoider blev genereret fra multipotente stamfædre af tidlige gastrula fase X.Laevis embryoner. De organoider har en moden epidermis, der er umulig at skelne fra en tadpole, herunder en fuldt differentieret epitel, slim udskiller bæger celler, multikilierede celler og små sekretoriske celler.
Dynamikken i organoid udvikling blev efterfulgt af levende billeddannelse. For at undersøge epiteliseringen, der opstår i det tidlige stadium af organoiddannelse, blev embryonerne mærket med fluorescerende mærkede stramme krydsproteiner og membran lokaliserende proteiner. Med dobbelt mærkning de sekventielle trin i ZO-1 positive stramme krydset dannelse kan markeres og kvantitativt analyseres under epitelisering.
Nogle regioner af celle-celle vedhæftning har spredt punktform og ZO-1 på forskellige stadier af epitelisering. I modsætning hertil har andre områder fuldt samlet sammenhængende ZO-1 udtryk. Over tid puncta sammensne og forbinde til at danne sammenhængende stramme vejkryds, som bevarer deres morfologi selv under celledeling.
Som de stramme vejkryds modnes, bevæger cellerne sig dynamisk ind og ud af overfladen langs de apikale planer i organoiderne. Multi-skala analyse er muligt ved at spore celler spatio-tidsmæssigt på overfladen af differentiere organoids. Når du forsøger denne protokol, skal du huske at sætte den mørkpigmenterede side af den isolerede dyrehætte opad og overvåge den under et stereoscope.
Det er afgørende at adskille det overfladiske lag af dyrehætten på den rigtige timing i calcium/magnesiumfri DFA-medier. Denne enkle protokol tilbyder praktiske måder at studere dynamisk celle adfærd samt de molekylære og fysiske mekanismer, der regulerer mucociliary epitel.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
