Neuroscience
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Imersão alternativa em glicose para produzir hiperglicemia prolongada em zebrafish
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Summary May 5th, 2021
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Este protocolo invasivamente induz hiperglicemia em zebrafish por até 8 semanas. Usando este protocolo, um estudo aprofundado dos efeitos adversos da hiperglicemia pode ser feito.
Transcript
Este protocolo induz a hiperglicemia em peixes zebras em um padrão de ascensão e queda que imita a hiperglicemia que é vista no diabetes tipo dois. A principal vantagem dessa técnica é que é uma técnica não invasiva que torna possível garantir que a hiperglicemia seja a causa de quaisquer alterações observadas no peixe hiperglicímico. Este protocolo poderia potencialmente ser usado para explorar vias terapêuticas ou fármacos que visam complicações da hiperglicemia.
Este protocolo tem um monte de etapas, mas quando os passos são seguidos corretamente e com cuidado, ele deve rapidamente se tornar segunda natureza. Lembre-se, no entanto, para sempre tratar os animais de forma suave e humana durante todo o protocolo. Comece montando seis tanques, dois para cada grupo experimental.
Utilize dois tanques de litro, se o número total de peixes for inferior a 20 e quatro litros se o número total de peixes for superior a 20. Rotule um dos dois tanques, tanque de habitação e o outro tanque de solução. Mantenha os tanques em um banho de água a 28 a 29 graus Celsius para manter a temperatura da água.
No primeiro dia, coloque os peixes em suas respectivas soluções de tratamento por 24 horas. No segundo dia, transfira os peixes de suas soluções de tratamento para a água por 24 horas. No terceiro dia, transfira os peixes da água para soluções de tratamento.
Continue esta exposição alternada para o restante do experimento. Transferência de água tratada controle peixe de água para água diariamente. Certifique-se de que os peixes são alimentados e transferidos dentro da mesma janela de duas horas por dia durante toda a duração do experimento.
Transfira peixes em cada grupo de tratamento do tanque de habitação para o tanque de solução correspondente usando uma rede de peixe padrão. Coloque o tanque contendo o peixe de volta no banho de água e substitua a pedra de ar e a tampa do tanque. Este tanque é agora o tanque de habitação e o tanque que anteriormente segurava o peixe é agora o tanque de solução.
Descarte a solução antiga e limpe o tanque junto com as tampas do tanque, linhas de ar, pedras de ar e redes para evitar o acúmulo de glicose e manitol. Use água e uma esponja dedicada para cada condição de tratamento para limpar adequadamente os tanques. Seque os tanques de solução recém-limpos com uma toalha de papel e prepare as soluções para o dia seguinte usando este tanque.
Certifique-se de que os outros itens são secos e separados por grupos de tratamento apropriados. Para preparar as soluções de açúcar, encha cada tanque de solução com dois ou quatro litros de água do sistema. Meça a quantidade correta de glicose e manitol usando uma balança de carregamento superior e barcos de pesagem separados para cada produto químico.
Adicione a glicose ponderada ou aliquot mannitol ao tanque de solução limpa apropriado. Mexa as soluções com hastes de mexidas de vidro separadas até que os açúcares estejam completamente dissolvidos. Em seguida, devolva os tanques de solução para o banho de água e cubra-os com suas tampas correspondentes.
Para preparar a solução de água, encha os tanques experimentais com água do sistema Devolva esses tanques de solução para o banho de água e cubra-os com suas tampas correspondentes. Os valores de açúcar no sangue foram significativamente elevados após os tratamentos de glicemia de quatro semanas e oito semanas. Com hiperglicemia definida como três vezes a média de controle tanto de grupos tratados com água quanto de manitol.
Tecido retiniano coletado após quatro semanas de hiperglicemia teve um aumento nos níveis de proteína ácida fibrilar gliana ou GFAP. A expressão GFAP é observada em células gliais de Mueller na retina, que são alteradas na retinopatia diabética. Esse aumento da GFAP esteve associado ao aumento dos níveis de kappaB de fator nuclear.
Sugerindo que a hiperglicemia induzida desencadeia uma resposta inflamatória e gliose reativa. As gravações de ERG após quatro semanas de tratamento identificaram uma diminuição da resposta nas retinas tratadas com glicose em comparação com os controles tratados com manitol. Amplitudes de componentes fotorreceptor e células bipolares foram diminuídas em peixes hiperglicêmicos.
Este procedimento pode ser complementado por outros testes de hiperglicemia. Por exemplo, um ensaio de memória pode ser usado para olhar para déficits cognitivos ou registrar respostas visuais, como a resposta optomotor para avaliar complicações baseadas na visão. Uma vez estabelecida essa técnica, nosso laboratório foi capaz de usá-la para estudar complicações induzidas por hiperglicemia no modelo de peixe-zebra.
Observamos essas complicações relativamente rapidamente, após quatro semanas de tratamento.
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