Bioengineering
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Trinvis celle såning på Tessellated stilladser til undersøgelse spirende blodkar
Chapters
Summary January 14th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Manipuleret væv er stærkt afhængige af ordentlige vaskulære netværk til at levere vitale næringsstoffer og gasser og fjerne metabolisk affald. I dette arbejde skaber en trinvis såningsprotokol af endotelceller og støtteceller højt organiserede vaskulære netværk i en højoverførselshastighedsplatform til undersøgelse af udvikling af fartøjsadfærd i et kontrolleret 3D-miljø.
Transcript
Vores protokol giver forskere mulighed for at studere skibets netværksdannelsesproces på en klar og let sporbar måde, åbne dørene for nye undersøgelser og kaste lys over blodkaradfærd. Denne teknik giver mulighed for at skabe velorganiserede og repeterbare vaskulære netværk med reagere på det omgivende miljø. Endotelceller fra patienter, der lider af en vaskulær sygdom, kan hentes ved hjælp af dette system, hvilket gør det muligt at genskabe den vaskulære sygdom og finde en passende behandling.
Den foreslåede metode kan udvides til at studere vaskulær netværksadfærd, når den er parret med forskellige celletyper, hvilket gør det muligt at observere samspillet mellem at udvikle fartøjer med en bestemt vævstype. Begynd med at nedsænke stilladserne i 70% ethanol i mindst 15 minutter, og vask dem derefter to gange i PBS. Bland 1,5 mikroliter fibronectin lageropløsning med 28,5 mikroliter PBS per stillads, der skal sås.
Forbered en fibronectin fortynding, der skal anvendes til alle stilladser for at undgå pipettering fejl. Sæt stilladserne sparsomt oven på en hydrofobisk overflade og dæk hvert stillads med 30 mikroliter af fibronectinfortyndingen. Udskift pladens låg og læg de fibronectindækkede stilladser i en inkubator, der er indstillet til 37 grader Celsius og 100% fugtighed i mindst en time.
Efter inkubation skylles stilladserne i PBS let for at fjerne fibronectinrester. Stilladserne kan opbevares i PBS ved fire grader Celsius i op til en uge. Forbered endotelcelle eller EF-medium ved at blande basalmediet med de tilsvarende medium kit-komponenter, herunder en antibiotisk opløsning, FBS og endotelcellevæksttilskud som angivet af producenten.
Gør den menneskelige fedt mikrovaskulære endotelcelle suspension i EF-medium med en koncentration på fire millioner celler pr milliliter. Brug pincet, placere en fibronectin-belagt stillads per brønd i en ikke-TC 24-brønd plade. Dæk hvert stillads med 25 mikroliterdråber af celleaffjedringen, og sørg for ikke at lade suspensionen flyde væk fra stilladset.
Læg låget på pladen og læg det i en inkubator ved 37 grader Celsius, 5% kuldioxid og 100% fugtighed i 60 til 90 minutter. Efter inkubationen fyldes hver brønd med 700 mikroliter EF-medium. Inkubat de endoteliserede stilladser, indtil EF-sammenløbet kan observeres ved hjælp af fluorescerende mikroskopi eller i tre dage.
Skift mediet hver anden dag. Forbered DPSC medium ved at blande 500 milliliter lav glukose DMEM, 57,5 milliliter FBS, 5,75 milliliter ikke-essentielle aminosyrer, 5,75 milliliter GlutaMAX og 5,75 milliliter penicillin-streptomycin-nystatin opløsning. Overfør de endoteliserede stilladser til en ny ikke-TC 24-brønds plade.
Kassér alle medier fra den aktuelle plade ved hjælp af en pipette eller vakuumsugning, og pas på ikke at påføre vakuum direkte på stilladset. Placer et stillads i midten af hver brønd, og tør derefter det omkringliggende område med let vakuum. Der fortyndes thrombin- og fibrinogenbestandsopløsninger med PBS til en endelig koncentration på henholdsvis fem enheder pr. milliliter og 15 mg/milliliter.
Forbered en otte millioner DPSC per milliliter suspension i thrombin fortynding og distribuere 12,5 mikroliter af suspensionen i de enkelte mikrorør per stillads, der skal seedede. Sæt en fem til 50 mikroliter pipette til 12,5 mikroliter og fyld den med fibrinogenopløsning. Uden at fjerne spidsen skal du indstille pipetten til 25 mikroliter.
Materialet i spidsen skal stige og efterlade et tomt volumen. Tryk langsomt på stemplet, indtil væsken når spidsens åbning, men siver ikke ud. Hold stemplet i denne position, og sæt spidsen i et af de mikrocentrifugerør, der indeholder cellerne i thrombinaffjedring, og sørg for, at spidsen er i kontakt med væsken.
Slip forsigtigt stemplets knap, og træk celleaffjedringen ind i spidsen. Bland begge materialer grundigt, så bobledannelsen undgås. Pak hurtigt de blandede materialer oven på et endoteliseret stillads.
Gentag de foregående trin for hvert stillads, og sørg for at ændre spidser mellem anvendelser for at undgå uventet fibrin geldannelse i spidsen. Udskift pladelåget og inkubter stilladserne ved 37 grader Celsius, 5%kuldioxid og 100% fugtighed i 30 minutter. Efter inkubation fyldes hver brønd med en milliliter en-til-en DPSC og EF-medium.
Kultur i en uge, ændre mediet hver anden dag. På forskellige tidspunkter i kulturen skal du fjerne mediet fra brønden og billedet konstruererne ved hjælp af et konfokalt mikroskop for at studere den vaskulære udvikling eller enhver anden parameter af interesse. Denne protokol giver mulighed for fremstilling af tessellated stilladser lavet af SU-8 fotoresist.
Stilladser med forskellige rumgeometrier og meget nøjagtige og repeterbare funktioner blev opnået. Med traditionel samtidig såning af både endotelceller og støtteceller blev cellerne homogent fordelt over stilladset, hvilket resulterede i uforudsigelige og uorganiserede vaskulære netværk. Modsat, trinvis celle såning resulterede i velorganiserede vaskulære netværk.
Når du bruger fluorescerende endotelceller, kan fartøjerne afbildes i realtid. Rødt fluorescerende protein, der udtrykker endotelceller, blev dyrket på sekskantede stilladser og afbildet. Støttecellerne blev tilføjet på dag ét, og de vaskulære netværk blev afbildet hver anden dag for at kvantificere fartøjsudvikling.
For hvert tidspunkt blev der taget brede billeder af hele stilladset. Fartøjsvæksten blev kvantificeret som fartøjets samlede længde og areal. Der blev udført en konfokal billeddannelsestid for at tillade sporing af enkelte fartøjer ved hjælp af flerfarvede endotelceller.
Fartøjsstien blev genereret fra tidsforskydningen, hvilket gjorde det muligt at observere fartøjets migration. Karmodning blev observeret ved tilstedeværelsen af glatte muskelhandlinger og støtteceller. For de cirkulære, sekskantede og firkantede rum formere cellerne sig og organisere sig i strukturer.
På dag syv viste alle former et rigt og komplekst vaskulært netværk. Højere forstørrelse billeder afslørede en tættere glat muskel actin og støtte celle tilstedeværelse co-lokaliseret med dannede fartøjer, evidencing støtte celle rekruttering og differentiering omkring vaskulære strukturer. Denne teknik kan bruges til at studere adfærden af tredimensionelle vaskulære netværk, når de udsættes for forskellige forhold, såsom specifikke cellehæmmere eller i nærværelse af yderligere celletyper.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
