Semina cellulare graduale su impalcature tassellate per studiare i vasi sanguigni germogliati

Il nostro protocollo consente ai ricercatori di studiare il processo di formazione della rete dei vasi in modo chiaro e facilmente tracciabile, aprendo le porte a nuovi studi e facendo luce sul comportamento dei vasi sanguigni. Questa tecnica presenta la possibilità di creare reti vascolari altamente organizzate e ripetibili con risposta all’ambiente circostante. Le cellule endoteliali di pazienti affetti da una malattia vascolare possono essere recuperate utilizzando questo sistema, rendendo possibile ricreare la malattia vascolare e trovare un trattamento appropriato.

Il metodo proposto può essere esteso per lo studio del comportamento della rete vascolare se abbinato a diversi tipi di cellule, consentendo di osservare l’interazione dei vasi in via di sviluppo con un tipo di tessuto specifico. Iniziare immergendo le impalcature in 70%etanolo per un minimo di 15 minuti, quindi lavarle due volte in PBS. Mescolare 1,5 microlitri di soluzione di fibronectina stock con 28,5 microlitri di PBS per impalcatura da seminare.

Preparare una diluizione di fibronectina da utilizzare per tutte le impalcature per evitare errori di pipettaggio. Posizionare le impalcature in modo sparso sopra una superficie idrofobica e coprire ogni impalcatura con 30 microlitri della diluizione della fibronectina. Sostituire il coperchio della piastra e mettere le impalcature coperte di fibronectina in un’incubatrice impostata su 37 gradi Celsius e umidità al 100% per un minimo di un’ora.

Dopo l’incubazione, sciacquare leggermente le impalcature in PBS per rimuovere i resti di fibronectina. Le impalcature possono essere conservate in PBS a quattro gradi Celsius per un massimo di una settimana. Preparare la cellula endoteliale o il mezzo EC mescolando il mezzo basale con i corrispondenti componenti del kit medio, tra cui una soluzione antibiotica, FBS e integratori per la crescita delle cellule endoteliali come indicato dal produttore.

Effettuare la sospensione cellulare endoteliale microvascolare adiposa umana in mezzo CE con una concentrazione di quattro milioni di cellule per millilitro. Utilizzando le forcep, posizionare un’impalcatura rivestita con fibronectina per pozzo in una piastra non TC da 24. Coprire ogni impalcatura con 25 goccioline di microliter della sospensione cellulare, assicurandosi di non lasciare che la sospensione fluisca lontano dall’impalcatura.

Metti il coperchio sul piatto e posizionalo in un’incubatrice a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e umidità del 100% per 60-90 minuti. Dopo l’incubazione, riempire ogni bene con 700 microlitri di mezzo CE. Incubare le impalcature endotelializzate fino a quando non si può osservare la confluenza EC usando la microscopia fluorescente o per tre giorni.

Cambia il mezzo a giorni dall’altra. Preparare il mezzo DPSC mescolando 500 millilitri di DMEM a basso glucosio, 57,5 millilitri di FBS, 5,75 millilitri di amminoacidi non essenziali, 5,75 millilitri di GlutaMAX e 5,75 millilitri di soluzione di penicillina-streptomicina-nystatina. Trasferire le impalcature endotelializzate in una nuova piastra non TC a 24 pozza.

Scartare tutti i supporti dalla piastra corrente utilizzando una pipetta o un’aspirazione sottovuoto, facendo attenzione a non applicare il vuoto direttamente sull’impalcatura. Posizionare un’impalcatura al centro di ogni pozzo, quindi asciugare l’area circostante con un leggero vuoto. Diluire le soluzioni stock di trombina e fibrinogeno con PBS ad una concentrazione finale rispettivamente di cinque unità per millilitro e 15 milligrammi per millilitro.

Preparare un otto milioni di DPSC per sospensione millilitro nella diluizione della trombina e distribuire 12,5 microlitri della sospensione in singoli microtubi per impalcatura da seminare. Impostare una pipetta da cinque a 50 microlitri su 12,5 microlitri e riempirla con una soluzione di fibrinogeno. Senza rimuovere la punta, impostare la pipetta su 25 microlitri.

Il materiale nella punta dovrebbe alzarsi e lasciare un volume vuoto. Premere lentamente il pulsante dello stantuffo fino a quando il liquido non raggiunge l’apertura della punta, ma non fuoriesci. Tenere lo stantuffo in questa posizione e mettere la punta in uno dei tubi di microcentrifugo contenenti le celle in sospensione trombina, assicurandosi che la punta sia a contatto con il liquido.

Rilasciare delicatamente il pulsante dello stantuffo e disegnare la sospensione cellulare nella punta. Mescolare accuratamente entrambi i materiali, evitando la formazione di bolle. Erogare rapidamente i materiali misti sopra un’impalcatura endoteliale.

Ripetere i passaggi precedenti per ogni impalcatura, assicurandosi di cambiare le punte tra gli usi per evitare una formazione imprevista di gel di fibrina all’interno della punta. Sostituire il coperchio della piastra e incubare le impalcature a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica e 100% di umidità per 30 minuti. Dopo l’incubazione, riempire ogni bene con un millilitro di DPSC uno a uno e mezzo EC.

Cultura per una settimana, cambiando il mezzo a giorni nostri. In diversi punti di tempo durante la coltura, rimuovere il mezzo dal pozzo e immagini i costrutti usando un microscopio confocale per studiare lo sviluppo vascolare o qualsiasi altro parametro di interesse. Questo protocollo consente la fabbricazione di impalcature tassellate realizzate in fotoresist SU-8.

Sono state ottenute impalcature con geometrie distinte del compartimento e caratteristiche altamente accurate e ripetibili. Con la tradizionale semina simultanea di cellule endoteliali e cellule di supporto, le cellule erano distribuite in modo omogeneo sull’impalcatura con conseguente reti vascolari imprevedibili e disorganizzate. Al contrario, la semina graduale delle cellule ha portato a reti vascolari altamente organizzate.

Quando si utilizzano cellule endoteliali fluorescenti, i vasi possono essere immagini in tempo reale. Le proteine fluorescenti rosse che esprimono cellule endoteliali sono state coltivate su impalcature esagonali e immagini. Le cellule di supporto sono state aggiunte al primo giorno e le reti vascolari sono state immagini a giorni nostri per quantificare lo sviluppo delle navi.

Per ogni punto di tempo sono state scattate ampie immagini dell’intera impalcatura. La crescita delle navi è stata quantificata come lunghezza e superficie totali delle navi. È stato eseguito un time-lapse di imaging confocale per consentire il tracciamento di singoli vasi utilizzando cellule endoteliali multicolori.

Il percorso della nave è stato generato dal time-lapse, rendendo possibile osservare la migrazione delle navi. La maturazione dei vasi è stata osservata dalla presenza di actina muscolare liscia e cellule di supporto. Per i compartimenti circolari, esagonali e quadrati, le cellule si moltiplicano e si organizzano in strutture.

Al settimo giorno, tutte le forme mostravano una rete vascolare ricca e complessa. Immagini di ingrandimento più elevate hanno rivelato un actina muscolare più denso e liscio e supportano la presenza cellulare co-localizzata con vasi formati, evidenziando il reclutamento cellulare di supporto e la differenziazione che circonda le strutture vascolari. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare il comportamento delle reti vascolari tridimensionali quando esposte a condizioni diverse, come specifici inibitori cellulari o in presenza di tipi di cellule aggiuntive.