Neuroscience
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Stereocilia Bundle Imaging med upplösning i nanoskala i levande däggdjurs auditiva hårceller
Chapters
Summary January 21st, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll för Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (HPICM), en beröringsfri skanningssondteknik som möjliggör nanoskala av avbildning av stereocilia-buntar i levande hörselhårceller.
Transcript
Detta praktiska kan hjälpa oss att studera dynamiska förändringar av nanostrukturkomponenterna i den mekaniska elektriska flyttningsmaskineriet vid ytan av hårcellsstereociliabuntar. Den största fördelen med denna teknik är tidsfördröjningsavbildningen av ytan av levande celler med komplex topografi vid en enda nanometerupplösning och utan att få fysisk kontakt med provet. Denna teknik kan tillämpas på nästan alla levande celler.
Vi matchade tidigare ytan av lung epitelial cellinjer infekterade med virus, muskelceller, i Min bild bakterier snart. Testa nanopipetterna i början av varje bildbehandlingssession. Efter att ha tillverkat en nanopipette, kontrollera om det finns bubblor, ta bort eventuella bubblor om det finns och montera nanopipetten på hoppsondjonledningsmikroskoppipettens hållare.
Vid fyra milliliter badlösning till kammaren och placera kammaren på HPICM-scenen. Introducera jordelektroden till badlösningen och se till att spänningen som appliceras på pipetten genom plåsterklämmaförstärkaren är noll. När du har placerat mikromanipulatorn i vertikalt läge, flytta pipetten i Z tills den vidrör vätskan och ställ in förstärkarens förskjutning till noll, innan du lägger till plus 100 millivolt för att kontrollera pipettströmmen.
Använd silikonlim för att fästa AFM-kalibreringsstandarden i kammaren och täck provet med fyra milliliter HBSS. Använd dubbelhäftande tejp för att fästa kammaren i X Y-stadiet i HPICM-installationen och ladda en ny nanopipett på hållaren enligt vad som visas. Efter att ha testat nanopipettens motstånd och diameter ställer du in strömmen på en nanoförstärkare.
Använd en manipulator för grov plåsterklämma för att placera nanopipetten ungefär ovanför kalibreringsstandardens mittpunkt och öka intningen samtidigt som du övervakar signalen från Z piezo-ställdonets sensor på ett oscilloskop i realtid. Efter att ha etablerat en stabil repeterbar Z-inflygningscykel, minska börvärdet till värdet strax ovanför instabilitetspunkten och flytta pipetten ner med en hastighet av cirka fem mikron per sekund tills den når provet. Bottennivån för Z-positioneringssignalen i realtid kommer att öka, vilket indikerar att nanopipetten dras tillbaka på grund av att provytan känner av.
På grund av ojämn montering på AFM-standarden kan den högsta punkten i intresseområdet vara okänd. Ställ därför in amplituden för pipettens upprullning på minst 200 till 500 nanometer. Var försiktig så att du inte överskrider den övre gränsen för Z piezo-ställdonsrörelsen, börja avbilda vid låg upplösning.
När provets högsta punkt i bildområdet har identifierats, minska humleamplituden och dra tillbaka pipetten cirka 200 mikron längs Z-axeln för att förhindra oönskad kollision med provet innan du flyttar den till en ny X Y-plats. När intresseområdet har lokaliserats, börja avbildning med högre upplösning. För auditiv hårcellsavbildning, säkra fast ett nyisolerat organ av Corti till en kammare med antingen tandtråd eller flexibla glaspipetter.
Använd dubbelhäftande tejp för att ordentligt fästa kammaren på X Y piezo-scenen och ladda en ny nanopipett på hållaren enligt vad som visas. Efter att ha kontrollerat nanopipettens motstånd, använd patchklämma mikro manipulatorn för att placera nanopipetten över hårcellsregionen medan du observerar Corti X-växtens organ i ett inverterat mikroskop. Registrera, realtidsströmmen och Z-positioneringssignalen på oscilloskopet för att kontrollera om systemet är stabilt med en börspunkt på 0,5%6or lägre och bestämma den optimala börspunkten och närma sig provet enligt vad som visas.
Utför lågupplöst avbildning av provet enligt en humle amplitud på minst sex till åtta mikron. Om nanopipetten behöver flyttas till en ny X Y-plats, dra tillbaka pipetten ca 500 nanometer för att undvika en kollision med några höga funktioner i vävnaden och upprepa den lågupplösta HPICM-avbildningen tills den region av intresse där hårcellerna är belägna. Avbilda sedan den intressanta regionen med en högre upplösning på 15 minuter eller mindre.
HPICM-protokollet kan användas för att visualisera alla levande celler med en komplex topografi, till exempel levande råtta auditiva hårcellsbuntar. Trots att hpicm-bilder visar en lägre X Y-upplösning jämfört med att skanna elektronmikroskopibilder kan hpicm-bilder framgångsrikt lösa de olika raderna av stereocilia. Formen på stereociliaspetsarna och till och med de små fem nanometerlänkarna som förbinder den intilliggande stereocilia.
Med tanke på hpicm-avbildningens kontaktfria karaktär kan kontinuerlig tidsfördröjning av samma hårcellsbunt utföras i flera timmar utan att skada buntsammanhållningen. Observera att systemet med en mycket låg börspunkt kan tolka små fluktuationer i strömmen som att de stöter på cellytan, vilket leder till vitt punktbrus i bilden. På samma sätt kan stora humleamplituder öka pipettens laterala resonans, vilket också resulterar i produktion av bullriga pixlar.
Om humleamplitituden däremot är för liten eller börvärdet är för högt, kan nanopipetten kollidera med provet, vilket resulterar i bildetefakter eller hårbuntsskador. Det viktigaste att komma ihåg när du försöker denna procedur är att spendera mindre än 15 minuter per hårcellsbunt när du arbetar med levande celler. Efter att ha fått en bild av hårbunten kan man försöka få inspelningar med en kanal från specifika platser på ytan av stereocilia för att svara på frågor om egenskaper hos mekanotransduktionskanaler.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
