Neuroscience
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Imagerie de faisceaux stéréocilaires avec résolution à l’échelle nanométrique dans des cellules ciliées auditives de mammifères vivants
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Summary January 21st, 2021
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Nous présentons ici un protocole pour la microscopie à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM), une technique de sonde à balayage sans contact qui permet l’imagerie à l’échelle nanométrique des faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées auditives vivantes.
Transcript
Cette pratique peut nous aider à étudier les changements dynamiques des composants nanostructuraux de la machinerie mécanique de transduction électrique à la surface des faisceaux stéréocils des cellules ciliées. Le principal avantage de cette technique est l’imagerie en accéléré de la surface de cellules vivantes avec une topographie complexe à une résolution nanométrique unique, et sans entrer en contact physique avec l’échantillon. Cette technique peut être appliquée à presque toutes les cellules vivantes.
Nous avons précédemment apparié la surface des lignées cellulaires épithéliales pulmonaires infectées par des virus, des cellules musculaires, dans My Image Bacteria Soon. Testez les nanopipettes au début de chaque séance d’imagerie. Après avoir fabriqué une nanopipette, vérifiez la présence de bulles, retirez les bulles si elles sont présentes et montez la nanopipette sur le porte-pipette du microscope à conductance ionique de la sonde sautillante.
À quatre millilitres de solution de bain dans la chambre et placez la chambre sur l’étage HPICM. Introduisez l’électrode de terre dans la solution de bain et assurez-vous que la tension appliquée à la pipette à travers l’amplificateur de pince de patch est nulle. Après avoir placé le micro-manipulateur en position verticale, déplacez la pipette en Z jusqu’à ce qu’elle touche le liquide et réglez le décalage de l’amplificateur à zéro, avant d’ajouter plus 100 millivolts pour vérifier le courant de la pipette.
Utilisez de la colle au silicium pour fixer l’étalon d’étalonnage AFM à la chambre et recouvrir l’échantillon de quatre millilitres de HBSS. Utilisez du ruban adhésif double face pour fixer la chambre à l’étage X Y de la configuration HPICM et chargez une nouvelle nanopipette sur le support, comme illustré. Après avoir testé la résistance et le diamètre de la nanopipette, réglez le courant sur un nano ampli.
Utilisez un manipulateur de pince à patch grossier pour positionner la nanopipette approximativement au-dessus du centre de l’étalon d’étalonnage et augmenter le point de consigne tout en surveillant le signal du capteur de l’actionneur piézoélectrique Z sur un oscilloscope en temps réel. Après avoir établi un cycle d’approche Z reproductible stable, diminuez le point de consigne à la valeur juste au-dessus du point d’instabilité et déplacez la pipette vers le bas à une vitesse d’environ cinq microns par seconde, jusqu’à ce qu’elle atteigne l’échantillon. Le niveau inférieur du signal de positionnement Z en temps réel augmentera, indiquant que la nanopipette est retirée en raison de la détection de la surface de l’échantillon.
En raison d’un montage inégal sur la norme AFM, le point le plus élevé de la zone d’intérêt peut être inconnu. Par conséquent, réglez l’amplitude de la rétraction de la pipette à au moins 200 à 500 nanomètres. En prenant soin de ne pas dépasser la limite supérieure du mouvement de l’actionneur piézoélectrique Z, commencez l’imagerie à basse résolution.
Une fois que le point le plus élevé de l’échantillon dans la zone d’imagerie a été identifié, diminuez l’amplitude du saut et rétractez la pipette d’environ 200 microns le long de l’axe Z pour éviter toute collision indésirable avec l’échantillon avant de le déplacer vers un nouvel emplacement X Y. Lorsque la zone d’intérêt a été localisée, commencez l’imagerie à une résolution plus élevée. Pour l’imagerie des cellules ciliées auditives, fixez fermement un organe de Corti fraîchement isolé à une chambre à l’aide de fil dentaire ou de pipettes en verre flexibles.
Utilisez du ruban adhésif double face pour fixer fermement la chambre à l’étage piézoélectrique X Y et chargez une nouvelle nanopipette sur le support, comme démontré. Après avoir vérifié la résistance de la nanopipette, utilisez le micro-manipulateur de pince de patch pour positionner la nanopipette sur la région de la cellule ciliée tout en observant l’organe de la plante Corti X dans un microscope inversé. Enregistrez le courant en temps réel et le signal de positionnement Z sur l’oscilloscope pour vérifier si le système est stable avec un point de consigne de 0,5 %6 ou moins, et déterminez le point de consigne optimal et approchez l’échantillon comme démontré.
Effectuer une imagerie à basse résolution de l’échantillon, comme démontré en utilisant une amplitude de saut d’au moins six à huit microns. Si la nanopipette doit être déplacée vers un nouvel emplacement X Y, rétractez la pipette d’environ 500 nanomètres pour éviter une collision avec des caractéristiques hautes dans le tissu et répétez l’imagerie HPICM à basse résolution jusqu’à la région d’intérêt où se trouvent les cellules ciliées. Ensuite, imagez la région d’intérêt à une résolution plus élevée en 15 minutes ou moins.
Le protocole HPICM peut être utilisé pour visualiser toutes les cellules vivantes avec une topographie complexe, telles que les faisceaux de cellules ciliées auditives de rats vivants. Malgré la démonstration d’une résolution X Y inférieure à celle des images de microscopie électronique à balayage, les images HPICM peuvent résoudre avec succès les différentes rangées de stéréocils. La forme des extrémités des stéréocils et même les petites liaisons de cinq nanomètres reliant les stéréocils adjacents.
Compte tenu de la nature sans contact de l’imagerie HPICM, l’imagerie accélérée continue du même faisceau de cellules ciliées peut être effectuée pendant plusieurs heures sans endommager la cohésion du faisceau. Notez qu’avec un point de consigne très bas, le système peut interpréter de petites fluctuations du courant comme rencontrant la surface de la cellule, entraînant un bruit de points blancs dans l’image. De même, de grandes amplitudes de houblon peuvent augmenter la résonance latérale de la pipette, ce qui entraîne également la production de pixels bruyants.
En revanche, si l’amplitude du saut est trop faible ou si le point de consigne est trop élevé, la nanopipette peut entrer en collision avec l’échantillon, ce qui entraîne des artefacts d’imagerie ou des dommages au faisceau de cheveux. La chose la plus importante à retenir lors de la tentative de cette procédure est de passer moins de 15 minutes par faisceau de cellules ciliées lorsque vous travaillez avec des cellules vivantes. Après avoir obtenu une image du faisceau de cheveux, on pourrait essayer d’obtenir des enregistrements à canal unique à partir d’endroits spécifiques à la surface des stéréocils pour répondre à des questions sur les propriétés du canal de mécanotransduction.
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