使用荧光标记肉瘤蛋白缩短多能干细胞衍生心肌细胞的肉瘤。

由于多能干细胞衍生的结核细胞发育不全，肉瘤功能难以评估。使用荧光标记肉瘤蛋白，我们现在可以获得肉瘤缩短。我们可以使用干细胞衍生的心肌细胞和荧光标记肉瘤蛋白来可视化肉瘤，并在体外评估其功能。

使用基于 AAV 的转导，我们可以将该方法扩展到任何患者衍生的诱导多能干细胞。这种方法可以扩展到心肌病治疗的发展，因为它可以用来直接评估与疾病相关的肉瘤功能障碍在体外。这种方法在心脏病学领域很有用，包括儿科心脏病学研究。

然而，它也可以应用于骨骼肌功能障碍的研究，如肌病。在减去四分化诱导的第二天，涂上一个六井板，每平方厘米的层压素-511 E8在PBS中稀释0.5微克，在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育30分钟。在潜伏接近尾声时，在37摄氏度下用重组试金素治疗人类诱导的多能干细胞三分钟。

当细胞分离后，将细胞收获到中等，辅以10%FBS进行计数，并在离心后以每两毫升AK02N介质的1.25倍10至5个细胞重新使用细胞，辅以层压素-511 E8和ROCK抑制剂。接下来，从六井板的每口井中吸出涂层溶液，并将两毫升细胞播种到每口井中。将板返回到细胞培养孵化器。

四天后，细胞达到80%的汇流。用两毫升RPMI加B27代替每口油井中的超高纳坦，每口井不加胰岛素介质，并辅以葛兰素-3抑制剂，以诱导分化。经过两天的分化，轻轻地用两毫升RPMI加B27代替介质，而没有胰岛素介质，每口井补充豪猪抑制剂。

细胞应该达到100%的汇流。在分化的第四天，用两毫升RPMI加B27代替超高纳特，每口井不穿胰岛素。细胞应该保持高密度，有些可能已经开始漂浮。

在分化的第7天和第9天，用两毫升RPMI加B27代替每口井中的超高纳坦，用胰岛素补充纯霉素，用于选择性多能干细胞衍生心肌细胞培养。此时，应在培养物中观察跳动细胞。要建立一种图案多能干细胞衍生心肌细胞培养，首先使用修补胶带去除定制PDMS邮票表面的任何灰尘，并短暂地将邮票浸入70%乙醇中。

使用空气除尘器从邮票表面去除乙醇，并用5至10微升0.5%MPC聚合物和乙醇处理表面。当聚合物完全干燥时，将邮票放在35毫米成像盘的聚合物盖片上，并在邮票上放置重量。10 分钟后，使用光显微镜确认图案已转移到盖唇上，并用 PBS 洗两次盘和盖唇。

第二次洗涤后，将盖唇涂上每平方厘米0.5至1微克的层压素-511 E8稀释在0.1%明胶中，在室温下孵育2至4小时。在分化的第10天，用PBS清洗细胞两次，然后用每口井一毫升重组试丁香在37摄氏度下治疗三到五分钟。计算后，以每毫升RPMI加B27的2.5至5倍10至5倍的细胞，辅以胰岛素，辅以纯霉素浓度，将1毫升细胞重新播种到板上，在37摄氏度下过夜孵育。

第二天早上，用新鲜的RPMI加B27代替超高纳坦，用胰岛素补充纯霉素，将细胞返回细胞培养孵化器，每周刷新介质两到三次，直到21至28天进行成像。对于 PCCSM 培养物中肉瘤缩短的延时成像，请将油涂抹到荧光聚焦显微镜的 100 倍客观镜头中，并在相关软件中选择实时成像条件。要获得良好的代表性数据，请选择最高帧速率，设置快门以打开，并在采集区域的作物中应用四乘四的装箱，以便在延时成像期间实现图像之间的最短间隔。

如果细胞的跳动率较低，则通过电场刺激唤起细胞，并开始延时记录，注意成像过程中成像场保持对焦。在成像期结束时，将延时图像保存到适当的文件夹中。要分析延时图像，请将一系列延时图像打开到 ImageJ 中，并调整图像的亮度和对比度，直到可以清楚地观察到肉瘤图案。

在”更多工具”菜单中，选择 SarcOptiM，并按下控制移位 P 和工具栏上的一微米按钮，以使用说明校准程序。然后划出一条线穿过肉瘤区域，用于测量肉瘤缩短，然后单击单细胞 AVI 开始肉瘤缩短分析。肉瘤标签、图案多能干细胞衍生心肌细胞的延时成像可用于测量不同时间点的肉瘤缩短。

为了克服在模式多能干细胞衍生心肌细胞培养中通常观察到的肉瘤杂乱无章，特定的PDMS邮票可用于培养条纹图案的多能干细胞衍生心肌细胞，与在非模式区域培养的细胞相比，它促进拉长细胞形状和更有条理的肉瘤模式。与非模式培养细胞相比，模式培养还促进更好的细胞收缩，并提供平滑的肉瘤长度轮廓。AAV 转导模式多能干细胞衍生心肌细胞在转导后三天内就沿着模式多能干细胞衍生心肌细胞表达肉瘤 GFP 信号，也可用于测量肉瘤收缩轮廓。

此外，在转导过程中添加抗爆霉素基因也可用于促进模式多能干细胞衍生心肌细胞选择，使其纯度超过 90%，以便于更轻松、更高质量的图像分析，因此必须识别具有线性移动的肉瘤区域，并以最高帧速率获取图像。利用这种方法，我们可以评估肉瘤蛋白成熟的作用，以研究来自疾病特异性患者衍生的iPS细胞的实验室心肌细胞中的肉瘤功能障碍。