Biology
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Eine kartographische 3D-Beschreibung der Zelle durch Kryo-Soft-Röntgentomographie
Chapters
Summary March 15th, 2021
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Hier wird ein Protokoll vorgestellt, das die Probenvorbereitungs- und Datenerfassungsschritte beschreibt, die in der Kryo-Soft-Röntgentomographie (SXT) erforderlich sind, um die Ultrastruktur ganzer kryokonservierter Zellen mit einer Auflösung von 25 nm Halbtonhöhe abzubilden.
Transcript
Die Kryo-Soft-Röntgentomographie kann quantitative wertvolle Informationen auf zellulärer Ebene liefern, die als eigenständige oder in Verbindung mit anderen bildgebenden Verfahren verwendet werden können. Sensorbild in einem gefrorenen hydratisierten Zustand, die zum Färben oder Schneiden benötigt werden. Darüber hinaus handelt es sich um eine Hochdurchsatztechnik, da jedes Tomogramm in nur wenigen Minuten gesammelt wird.
Die weiche Röntgen-Kryotomographie bietet eine perfekte Plattform, um den Prozess der Zellwiederherstellung in infizierten oder defekten Zellen auf Einzelzellebene zu verfolgen. Diese Technik kann die Wirksamkeit neuer antiviraler Medikamente oder einer Gentherapie melden, um die Infektion redigierter Phänotypen rückgängig zu machen. Um Proben in das Transmissionsröntgenmikroskop zu laden, kühlen Sie die Transferkammer mit flüssigem Stickstoff ab, bis sie weniger als 100 Kelvin erreicht.
Füllen Sie den Arbeitsplatz mit zusätzlichem flüssigem Stickstoff und schalten Sie die Heizung der Arbeitsplatzfelge ein. Wenn der Arbeitsplatzrand aufhört zu kochen, platzieren Sie die Kryobox mit den Gittern an den entsprechenden Stellen in der Workstation unter Kryobedingungen und laden Sie die Gitter auf die zuvor gekühlten Probenhalter. Laden Sie die Halter auf das Shuttle und schützen Sie sie mit den Abdeckungen.
Laden Sie das Shuttle mit weniger als 100 Kelvin in die Transferkammer und pumpen Sie die Kammer auf Niedervakuum. Befestigen Sie die Transferkammer am Mikroskop und folgen Sie dem Vakuumverfahren auf dem Bildschirm, um den Transferraum-Shuttle in das Mikroskop zu laden. Sobald sich das Shuttle mit den Proben im Mikroskop befindet, verwenden Sie den Roboterarm des Mikroskops, um einen Probenhalter auf den Probentisch zu übertragen.
Für die Hellfeldbebilderung des Gitters mit dem Online-Mikroskop für sichtbares Licht wählen Sie die Mikroskopkamera für sichtbares Licht aus und schalten Sie die LED-Quelle des sichtbaren Lichtmikroskops für die Hellfeldbildgebung ein. Klicken Sie auf Bewegung, Steuerung, Probe und Proben-Theta, um die Probe um minus 60 Grad zu drehen, so dass sie dem Objektiv des Mikroskops für sichtbares Licht zugewandt ist, und wählen Sie Bewegungssteuerung und Probe und Probe und ändern Sie Probe X und Probe Y, um die Probe in die erwarteten zentrierten Positionen zu verschieben. Wählen Sie Mikroskop, Erfassung, Erfassungseinstellungen, Erfassungsmodi, Kontinuierlich und Start und klicken Sie auf Bewegungssteuerung und Probe, um Probe Z auszuwählen, um den Fokus mit kleineren Schritten von bis zu fünf Mikrometern zu verfeinern, bis die Zellen und / oder die Löcher des Kohlenstoffträgerfilms im Fokus sind.
Wählen Sie dann Mikroskop, Erfassung, Erfassungseinstellungen, Erfassungsmodi, Mosaik und Start, um die Erfassung einer vollständigen Mosaikkarte des Rasters im Hellfeldmodus mit den Standardwerten für das Mosaik zu starten. Für die Mosaikbildgebung im Fluoreszenzmodus schalten Sie die LED-Quelle des sichtbaren Lichtmikroskops für die Hellfeldbildgebung aus und wählen Sie die LED-Lichtquelle, die der gewünschten Anregungswellenlänge entspricht, und den entsprechenden optischen Filter manuell am Setup aus. Wählen Sie Mikroskop, Erfassung, Erfassungseinstellungen, Erfassungsmodi, Kontinuierlich und Start und klicken Sie auf Bewegungssteuerung und Sample, um Sample Z auszuwählen, um den Fokus auf das Fluoreszenzbild zu verfeinern.
Klicken Sie dann auf Mikroskop, Erfassung, Erfassungseinstellungen, Erfassungsmodi, Mosaik und Start, um eine Mosaikkarte zu erfassen, die die X- und Y-Positionsparameter aus dem Hellfeldmosaik beibehält. Schalten Sie dann die LED-Lichtquelle aus. Für die Röntgenmosaikerfassung ändern Sie den Austrittsschlitz auf fünf Mikrometer und verwenden Sie eine einsekündige Belichtung bei MISTRAL.
Wählen Sie Mikroskop, Erfassung, Aufnahmeeinstellungen, Kameraeinstellungen und Binning aus, um den Fokus mithilfe der Z-Übersetzung der Probe anzupassen. Wählen Sie Motion Control und Sample, um Sample Z auszuwählen.Beginnen Sie in Schritten von fünf Mikrometern und verfeinern Sie den Fokus auf Schritte von 0,5 Mikrometern, bis die Zelle oder die Kohlefolienlöcher gut fokussiert sind. Um eine Mosaikkarte des Netzquadrats zu erhalten, klicken Sie auf Mikroskop, Erfassung, Erfassungseinstellungen, Erfassungsmodus, Mosaik und Start.
Wenn die Karte erfasst wurde, klicken Sie auf Bewegungssteuerung und Sample, und ändern Sie Sample X und Sample Y, um das Sample in eine flache Feldposition zu verschieben. Stellen Sie die Belichtungszeit bei MISTRAL auf eine Sekunde ein. Normalisieren Sie dann das aufgenommene Mosaik durch das flache Feldbild, um die Übertragung zu erhalten und das normalisierte Mosaik zu speichern.
Um die Probe auf der Rotationsachse mit der Drehung bei null Grad auszurichten, wählen Sie Bewegungssteuerung und Probe (Sample) aus, und ändern Sie die Probe X, die Probe Y und die Probe Z so, dass sie sich auf das KE der Zelle konzentrieren, die auf der Rotationsachse platziert werden soll. Um die Probe in eine positive Theta-Position zu drehen, wählen Sie Bewegungssteuerung und Probe (Sample) und ändern Sie Sample Theta in Positive Theta. Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie auf dem KE der Zelle zu zeichnen, die auf der Rotationsachse platziert werden soll.
Um die Probe in eine negative Theta-Position zu drehen, wählen Sie "Bewegungssteuerung" und "Sample" und ändern Sie das Sample-Theta in ein negatives Theta. Verwenden Sie das Linienwerkzeug, um eine Linie auf dem KE der Zelle zu zeichnen, die auf der Rotationsachse platziert werden soll. Wenn Sie sich an positiver oder negativer Theta-Position befinden, verwenden Sie die Z-Verschiebung, um das ausgewählte KE in die Mittelposition zwischen beiden Linien zu verschieben, und wiederholen Sie die Probendrehung, bis ein minimaler Abstand von Zeile zu Zeile erreicht ist.
Wenn das Sample-Theta gleich Null ist, verschieben Sie das Sample X um das Doppelte des Abstands, der erforderlich ist, um das ausgewählte Feature in die Mitte des Sichtfelds zu stellen, und verschieben Sie die Zonenplatte X, um das Feature wieder in die Mitte des Sichtfelds zu bringen. Um die Position der Zonenplatte Z in Bezug auf die neue Rotationsachse erneut zu optimieren, wählen Sie Mikroskop, Erfassung, Erfassungseinstellungen, Erfassungsmodi und Fokusserie und klicken Sie auf Start, um eine Zonenplatte Z-Fokusserie aufzuzeichnen. Klicken Sie dann auf Bewegungssteuerung und Zonenplatte, und wählen Sie Zonenplatte Z aus, um die Zonenplatte Z an die Position zu verschieben, an der sich die Probe im Fokus befindet.
Um ein Tomogramm zu erhalten, klicken Sie auf "Bewegungssteuerung" und "Abtast" und wählen Sie "Theta abtasten", um den negativen maximalen Winkel auf plus 0,1 zu verschieben. Klicken Sie auf Mikroskop, Aufnahme, Aufnahmeeinstellungen, Erfassungsmodi und Tomographie, um die Anzahl der Bilder als Gesamtzahl der Winkel unter Berücksichtigung des Bildes bei Winkel Null und des Winkelbereichs festzulegen und die Anzahl der Bilder festzulegen. Wählen Sie Winkelanfang und Winkelende, klicken Sie auf Mikroskop, Erfassung, Erfassungseinstellungen, Kameraeinstellungen und legen Sie die Belichtungszeit fest.
Klicken Sie auf Start, um die Erfassung der Tomographie-Tilt-Serie zu starten. Die ideale Probe sollte einzelne Zellen in der Mitte eines quadratischen Netzes haben, das in eine dünne Eisschicht eingebettet und von gut verteilten Goldfiducial-Markern umgeben ist. Viele verschiedene Organellen, wie Mitochondrien, endoplasmatische Retikula, Vakuolen und der Zellkern, sollten dank der quantitativen Rekonstruktion der linearen Absorptionskoeffizienten im endgültigen rekonstruierten Tomogramm unterschieden werden können.
In diesem Bild kann ein Quadrat mit höherer Zelldichte beobachtet werden. In diesem Beispiel war das Blotting weniger effizient, was zu einer dickeren Eisschicht mit Rissen führte. Obwohl in dieser Zubereitung einige größere Strukturen zu erkennen sind, gingen feine Details innerhalb des Rauschens und der körnigen Textur aufgrund der schlechten Verglasungsqualität des dicken Eises verloren.
Die kryokonservierte Probe sollte minimal gehandhabt werden, da die meisten Artefakte induziert werden, wenn sich die Proben in diesem Stadium befinden. Normalerweise verwenden Sie bei der korrelativen Kryo-Visible-Light-Photomikroskopie eine Kryo-Substrattomographie vor der Kryo-Substrattomographie. Darüber hinaus kann die Spektralmikroskopie an relevanten chemischen Elementen durchgeführt werden.
Dieses Protokoll füllt eine Nische, indem es in einer Probe und einem Auflösungsregime arbeitet, die mit keiner anderen direkten Bildgebungstechnik leicht zugänglich sind und eine Auflösung von wenigen Mikrometern und einer Auflösung von 30 Nanometern mit halber Tonhöhe ermöglichen.
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