In vivo Calcium Imaging i Mus Ringere Olive

Ringere oliven er den mest ventrale del af medulla, og er derfor yderst vanskeligt at nå i et levende dyr. Her introducerer vi en protokol til at udsætte den voksne musehjernestamme fra ventralsiden og bruge GRIN-linser til at registrere neuronal aktivitet i de ringere olivenneuroner, der udtrykker calciumsensorer. Denne metode undgår skader på livskritisk hjernestamme og muliggør undersøgelser af rumlige-tidsmæssige aktivitetsmønstre og inputintegration i den ringere oliven.

Da operationen udføres i den komplekse halsregion med mange vitale strukturer, er det vigtigt, at den udføres af en forsker med kirurgiske færdigheder på højt niveau. Forbered et intubationsrør ved at skære et 5 til 6 millimeter langt og 0,8 millimeter bredt slids fra spidsen af et 20 gauge kateter. Forbered en stump og buet nål ved at skære spidsen af, sand brudfladen, og bøje den med tangen.

Dette vil blive brugt til at understøtte en luftrør under trakeotomi. Fortynd 15 milligram pr. milliliter ketamin med saltvand til 15%Saml kirurgisk værktøj og forbrugsstoffer. Sæt varmepuden til 38 grader Celsius.

Drej nosecone 180 grader vandret i stereotaxic ramme. Afveje musen, hvis ringere oliven tidligere blev transfected af virus-regnskabsmæssige GCaMP6s, og beregne mængden af fortyndet ketamin til injektion. Forfyld induktionsboksen med 5%isoflurane, og bedøve musen.

Monter musen i den stereotaxiske ramme, ventral side op. Barber mus hals og lår område. Fjern resthåret med hårfjerningscreme.

Topisk anvende xylocain gelé på halsen hud. Overvåg musetemperaturen med en rektal termisk sensor. Injicere en milliliter forvarmet saltvand intraperitoneally.

Vurder anæstesiens dybde ved stærk knivspids på bagben. Der må ikke fremkaldes noget påviseligt svar. Lav et lodret snit i halsen hud langs midterlinjen.

Adskil nakkehud fra indvolde under det ved hjælp af stump dissektion metode og skære huden af. Gratis spytkirtler fra bindevæv, og flip dem sideværts at udsætte sternothyroid muskel-dækket luftrør. Intraperitoneally injicere den første dosis af fortyndet ketamin på fem milliliter per kilo animalsk vægt.

Del forsigtigt sternothyroidmusklen langs midterlinjen med spidsen af en fin pincet for at afsløre luftrør. Løsrive luftrør fra blodkar og spiserøret med pincet ved hjælp af stump dissektion metode. Der tilføres en anden dosis fortyndet ketamin ved 2,5 milliliter pr. kg animalsk vægt.

Skær en stump nål over under luftrøret. Løft luftrøret med den stumpe nål. Gør sutur tråd gå rundt om den tredje luftrør ring, kaudale skjoldbruskkirtlen, med en halv cirkel nål.

Lav fire instrumentbånd på denne ring. Pierce brystet huden med samme halvcirkel nål og føre tråden gennem huden. Løft forsigtigt luftrøret med tråden, og skær luftrøret caudal til skjoldbruskkirtlen.

Træk luftrøret mod brysthuden. Hæv åbningen af luftrøret ved at tilføje et lille stykke kirurgisk svamp under den. Fjern eventuel resterende væske inde i luftrørets åbningsspids med en tynd strimmel rengøringsvæv.

Skift isoflurane flow fra stereotaxic nosecone til intubation tube. Sæt intubationsrøret i luftrøret. Sørg for, at en del af slidsen i røret forbliver uden for luftrøret, så du kan trække vejret.

Fastgør luftrøret til musekiste huden ved at gøre tre til fire instrument bånd. Bind luftrøret med suturtråden for at sikre intubationsrøret. Skær sternothyroidmusklen langs muskelfibrene med de fine pincet.

Skær den isolerede del af med forårssaksen. Forsigtigt fri sidesten luftrør og strubehoved fra muskler for at minimere skaderne på blodkarrene i musklen. Fjern sidesten luftrør og strubehoved.

Gratis spiserøret fra fastgjort væv med pincet og skær det af med fjedersaks. Fjern den langsgående muskel, der dækker hjernestammen og atlassets ventralbue. Fjern musklen, der dækker atlas ventralbuen og den forreste tuberkel.

Skær de ventrale buer af atlas med rongeur. Fjern atlasets forreste tuberkel. Fjern blod og væske for at se foramen magnum og hjernestammen.

Udvid foramen magnum ved at fjerne nakkebenet med rongeuren. Fjern brusk, og forsigtigt skræl periosteal lag af dura mater med fine pincet at have et klart overblik over ventral hjernestammen. Klem SpO2-sensoren på musens lår for at overvåge vitale tegn såsom puls, iltmætning og åndedrætsfrekvens.

Monter GRIN-linsen på implantationsstangen. Rengør linsen forsigtigt med 70% ethanol-gennemblødt rengøringsvæv. Fastgør implantationsstangen på stereotaxic rammen og monter miniaturemikroskopet på implantationsstangen.

Tilføj flere dråber saltvand i hjernestammeområdet for nedsænkning af GRIN-linsen. Gå hen til hjernestammen med GRIN-linsen. GCaMP6s udtrykke ringere oliven neuroner i det overfladiske område kan findes i et rektangel formet region, omkring 0,5 til 1,7 millimeter rostral til de resterende atlas, og omkring 2,6 til 1,1 millimeter lateral til midterlinjen.

Tænd excitation blå LED i miniature mikroskop for at finde GCaMP6s transfected ringere oliven neuroner. Neuronerne viser forskellige baseline fluorescens intensitet på grund af forskellige GCaMP6s udtryk niveau. Ændringen af calcium niveau af kredsede ringere oliven neuron somata i videoen til venstre vil vist os delta F divideret med F spor til højre.

Selvom musen holdes varm og hydreret, vil den uundgåeligt blive svækket af langvarig anæstesi og kirurgi. Det er vigtigt at holde varigheden af operationen kort, så musen fysiske tilstand vil være god til optagelse. En dygtig forsker kan afslutte operationen i 70 minutter.

Denne metode, med modifikationer, kan bruges til at studere andre tilstødende regioner i ventrale hjernestammen.