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June 10, 2021
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अवर जैतून मेडुला का सबसे वेंट्रल हिस्सा है, और इस प्रकार एक जीवित जानवर में पहुंचना बेहद मुश्किल है। यहां, हम वेंट्रल साइड से वयस्क माउस मस्तिष्क स्टेम को बेनकाब करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं, और कैल्शियम सेंसर व्यक्त करने वाले अवर जैतून न्यूरॉन्स में न्यूरोनल गतिविधि रिकॉर्ड करने के लिए ग्रिन लेंस का उपयोग करते हैं। यह विधि जीवन-महत्वपूर्ण मस्तिष्क स्टेम को नुकसान से बचाती है, और अवर जैतून में स्थानिक-लौकिक गतिविधि पैटर्न और इनपुट एकीकरण पर जांच को सक्षम बनाती है।
चूंकि ऑपरेशन कई महत्वपूर्ण संरचनाओं के साथ जटिल गले क्षेत्र में किया जाता है, इसलिए यह आवश्यक है कि यह उच्च स्तरीय सर्जिकल कौशल वाले शोधकर्ता द्वारा आयोजित किया जाता है। 20 गेज कैथेटर की नोक से 5 से 6 मिलीमीटर लंबी और 0.8 मिलीमीटर चौड़ी झिरी काटकर एक इंस्टीबेशन ट्यूब तैयार करें। टिप को काटकर, फ्रैक्चर सतह को रेत करके एक कुंद और घुमावदार सुई तैयार करें, और इसे प्लियर के साथ मोड़ें।
इसका उपयोग ट्रेकिओटॉमी के दौरान एक श्वासनली का समर्थन करने के लिए किया जाएगा। 15 मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर केटामाइन नमकीन से 15% असेंबल सर्जरी उपकरण और उपभोग्य वस्तुओं के साथ। हीटिंग पैड को 38 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें।
स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम में नाक की तरह 180 डिग्री क्षैतिज रूप से चालू करें। माउस जिसका अवर जैतून पहले वायरस से संक्रमित था GCaMP6s ले वजन, और इंजेक्शन के लिए पतला केटामाइन की मात्रा की गणना । 5% आइसोफ्लुरेन के साथ प्री-फिल इंडक्शन बॉक्स, और माउस को एनेस्थेटाइज करें।
स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम, वेंट्रल साइड अप में माउस को माउंट करें। दाढ़ी माउस गला और जांघ क्षेत्र। हेयर रिमूवल क्रीम के साथ अवशिष्ट बालों को हटा दें।
सामयिक रूप से गले की त्वचा पर जाइलोकेन जेली लगाएं। एक गुदा थर्मल सेंसर के साथ माउस तापमान की निगरानी करें। एक मिलीलीटर पूर्व गरम खारा इंट्रापेरिटोनली इंजेक्ट करें।
हिंडलिम्ब पैर की उंगलियों पर मजबूत चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई का आकलन करें। कोई पता लगाने योग्य प्रतिक्रिया पैदा नहीं की जानी चाहिए । मिडलाइन के साथ गले की त्वचा में एक ऊर्ध्वाधर चीरा बनाएं।
कुंद विच्छेदन विधि का उपयोग करके इसके नीचे विसरा से गर्दन की त्वचा को अलग करें और त्वचा को काट दें। कनेक्टिव ऊतक से मुफ्त लार ग्रंथियों, और स्टर्नोथायराइड मांसपेशियों से ढके श्वासनली का पर्दाफाश करने के लिए उन्हें पार्श्व। इंट्रापेरिटोनली जानवरों के वजन के प्रति किलोग्राम पांच मिलीलीटर पर पतला केटामाइन की पहली खुराक इंजेक्ट करें।
श्वासनली को बेनकाब करने के लिए एक ठीक संदंश की नोक के साथ मिडलाइन के साथ स्टर्नोथायराइड मांसपेशी को सावधानी से विभाजित करें। कुंद विच्छेदन विधि का उपयोग करके रक्त वाहिकाओं और घेघा के साथ घेघा से अलग ट्रेकिया। जानवरों के वजन के प्रति किलोग्राम 2.5 मिलीलीटर पर पतला केटामाइन की दूसरी खुराक इंजेक्ट करें।
आड़े-तिरछे श्वासनली के नीचे एक कुंद सुई डालें। कुंद सुई के साथ श्वासनली लिफ्ट। सीवन धागा तीसरे श्वासनली अंगूठी के चारों ओर जाना बनाओ, थायराइड ग्रंथि कौडल, एक आधा सर्कल सुई के साथ ।
इस अंगूठी पर चार साधन संबंध बनाओ। छाती की त्वचा को उसी आधे सर्कल सुई से छेदें और त्वचा के माध्यम से धागे का नेतृत्व करें। धीरे-धीरे श्वासनली को धागे से उठाएं, और श्वासनली कौडल को थायराइड ग्रंथि में काट लें।
श्वासनली को छाती की त्वचा की ओर खींचें। इसके नीचे सर्जिकल स्पंज का एक छोटा सा टुकड़ा डालकर श्वासनली के उद्घाटन को उठाएं। सफाई ऊतक की एक पतली पट्टी के साथ श्वासनली के उद्घाटन टिप के अंदर किसी भी शेष तरल निकालें।
आइसोफ्लुनेव फ्लो को स्टीरियोटैक्सिक नोजकोन से इंस्टीक्यूबेशन ट्यूब पर स्विच करें। श्वासनली में इंस्टुबेशन ट्यूब डालें। सुनिश्चित करें कि ट्यूब में भट्ठा का हिस्सा सांस लेने की अनुमति देने के लिए श्वास के बाहर रहता है।
तीन से चार इंस्ट्रूमेंट संबंध बनाकर श्वासनली को माउस चेस्ट स्किन में ठीक करें। इंडबेशन ट्यूब को सुरक्षित करने के लिए ट्रेंचिंग थ्रेड के साथ श्वासनली बांधें। ठीक संदंश के साथ मांसपेशियों के तंतुओं के साथ स्टर्नोथायराइड मांसपेशी भट्ठा।
अलग-थलग हिस्से को स्प्रिंग कैंची से काट लें। मांसपेशियों में रक्त वाहिकाओं पर नुकसान को कम करने के लिए मांसपेशियों से सावधानी से बचे हुए श्वासनली और गला को मुक्त करें। बचे हुए श्वासनली और गला निकालें।
संदंश के साथ संलग्न ऊतक से मुक्त घेघा और वसंत कैंची के साथ इसे काट दिया। दिमाग और एटलस के वेंट्रल आर्क को कवर करने वाली देशांतरीय मांसपेशी को हटा दें। एटलस वेंट्रल आर्क और पूर्वकाल ट्यूबरकल को कवर करने वाली मांसपेशी को हटा दें।
रोंगर के साथ एटलस के वेंट्रल मेहराब को काटें। एटलस के पूर्वकाल ट्यूबरकल को हटा दें। फोरमेन मैग्नम और ब्रेन स्टेम को देखने के लिए खून और तरल पदार्थ निकालें।
रोंगर के साथ ऑक्सीपिटल हड्डी को हटाकर फोरमेन मैग्नम का विस्तार करें। उपास्थि को हटा दें, और वेंट्रल ब्रेनस्टेम का स्पष्ट दृश्य रखने के लिए दुरा मेटर की पेरिओस्टियल परत को ठीक संदंश के साथ सावधानी से छील लें। हृदय गति, ऑक्सीजन संतृप्ति और सांस की दर जैसे महत्वपूर्ण संकेतों की निगरानी के लिए माउस की जांघ पर SpO2 सेंसर को क्लैंप करें।
प्रत्यारोपण रॉड पर मुस्कराहट लेंस माउंट। लेंस को 70% इथेनॉल से लथपथ सफाई ऊतक के साथ ध्यान से साफ करें। स्टीरियोटैक्सिक फ्रेम पर इम्प्लांटेशन रॉड को ठीक करें और इम्प्लांटेशन रॉड पर मिनिएचर माइक्रोस्कोप माउंट करें।
ग्रिन लेंस के विसर्जन के लिए ब्रेनस्टेम क्षेत्र में नमकीन की कई बूंदें जोड़ें। ग्रिन लेंस के साथ ब्रेनस्टेम से संपर्क करें। सतही क्षेत्र में अवर जैतून न्यूरॉन्स व्यक्त GCaMP6s एक आयत के आकार के क्षेत्र में पाया जा सकता है, शेष एटलस के लिए लगभग 0.5 से 1.7 मिलीमीटर रोस्ट्रल, और मिडलाइन के लिए लगभग 2.6 से 1.1 मिलीमीटर पार्श्व।
GCaMP6s संक्रमित अवर जैतून न्यूरॉन्स का पता लगाने के लिए लघु माइक्रोस्कोप में उत्तेजन नीले एलईडी चालू करें। न्यूरॉन्स विभिन्न GCaMP6s अभिव्यक्ति के स्तर के कारण विभिन्न बेसलाइन फ्लोरेसेंस तीव्रता दिखाते हैं। बाईं ओर वीडियो में परिक्रमा अवर जैतून न्यूरॉन सोमता के कैल्शियम स्तर के परिवर्तन हमें डेल्टा एफ दाईं ओर एफ निशान से विभाजित दिखाया जाएगा ।
हालांकि माउस गर्म और हाइड्रेटेड रखा जाता है, यह अनिवार्य रूप से लंबे समय तक संज्ञाहरण और सर्जरी से कमजोर हो जाएगा । यह सर्जरी की अवधि कम रखने के लिए आवश्यक है तो माउस शारीरिक हालत रिकॉर्डिंग के लिए अच्छा होगा । एक कुशल शोधकर्ता सर्जरी को 70 मिनट में खत्म कर सकता है।
संशोधनों के साथ इस विधि का उपयोग वेंट्रल ब्रेनस्टेम के अन्य आसन्न क्षेत्रों का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
हम वेंट्रल साइड से वयस्क माउस के ब्रेनस्टेम को बेनकाब करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं। एक लघु माइक्रोस्कोप के साथ एक ढाल-अपवर्तक सूचकांक लेंस का उपयोग करके, कैल्शियम इमेजिंग का उपयोग वीवो में अवर जैतून तंत्रिका सोमाता की गतिविधि की जांच करने के लिए किया जा सकता है।
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Guo, D., Gürkan Özer, A., Uusisaari, M. Y. In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive. J. Vis. Exp. (172), e62222, doi:10.3791/62222 (2021).
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