This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generatie zebravislarven xenografts en tumorgedragsanalyse
Chapters
Summary June 19th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Hier bieden we een stapsgewijs protocol, met tips om xenograften te genereren en richtlijnen voor tumorgedragsanalyse, whole-mount immunofluorescentie en confocale beeldvorming kwantificering.
Transcript
Zebravis xenografts worden veel gebruikt voor kankeronderzoek. Je kunt menselijke tumorcellen nemen en injecteren in kleine larven zebravissen, of zelfs in volwassenen. Hier presenteren we een stapsgewijs protocol van het larvemodel, waar we verschillende menselijke kankermerken bij een levend dier kunnen bestuderen.
Je kunt proliferatie bestuderen, je kunt angiogenese bestuderen, je kunt metastase bestuderen, en ook interacties binnen de tumormicro-omgeving. En een groot voordeel is dat je dit in een zeer kort tijdsbestek kunt bestuderen. Slechts vier dagen, bijvoorbeeld.
Een ander groot voordeel is dat je dit live kunt bestuderen met een enkele celresolutie, met behulp van een confocale of een lichtbladmicroscoop. Je kunt bestuderen hoe cellen migreren, hoe cellen met elkaar communiceren of zelfs hoe ze met elkaar praten. Het is dus een heel krachtig model om kankerbiologie te bestuderen.
Zebravis xenografts kunnen worden gebruikt om de respons op antikankertherapieën te bestuderen, zoals chemotherapie, radiotherapie of zelfs gerichte therapieën met antilichamen. En ten slotte kan dit protocol ook worden aangepast om patiënt-afgeleide cellen uit een chirurgisch monster te gebruiken, of zelfs uit biopten, en vervolgens de zebravisavatars te genereren. Instellen voor injectie.
Twee weken voor injectie, breid de cellen uit in cultuur. Begin met overtollige cellen en overtollige vissen totdat je bedreven wordt met de techniek, omdat veel cellen en vissen verloren gaan tijdens de training. Tabel één van de bijbehorende PDF bevat een gedetailleerde gids met de optimale percentages in-vitro samenvloeiing voor injectie van verschillende cellijnen.
Steek drie dagen voor de injectie de zebravis van de gewenste achtergrond over. 24 uur voor injectie. Maak de zebravis embryoplaten schoon.
Gooi alle dode en niet-ontwikkelde embryo's weg en ververs het E3-medium. Gooi in de celkweekkamer het celkweekmedium weg. Was eenmaal met PBS 1X om de dode cellen te verwijderen en vers medium toe te voegen.
Bereid de hulpmiddelen voor de injectieprocedure voor, zoals micro-injectienaalden, agaroseplaten en haarspelden om de embryo's uit te lijnen voor injectie. Giet voor de plaatvoorbereiding een laag opgeloste 2% agarose in het deksel van een schone petrischaal. Laat het polymeriseren en maak met behulp van een liniaal drie tot vier rechte agaroselijnen voor de uitlijning van de embryo's.
Injectiedag. Scheid de uitgebroede embryo's van onbeschadigde eieren. Het toevoegen van Pronase aan het embryomedium in dit stadium kan het uitkomen stimuleren.
Plaats de embryo's in de incubator bij 28 graden Celsius tot injectie. Celetikettering voor injectie. Om te helpen bij het opzetten van een reproduceerbare celetiketteringstechniek, raadpleegt u de tabellen één en twee van het geschreven protocol voor een compilatie van een lijst met cellijnen en verschillende labeloplossingen.
Verwijder het celkweekmedium en was de kolf tweemaal met PBS 1X. Label de cellen met een lipofiele kleurstof, vermijd blootstelling aan licht en incubeer de kolf op 37 graden. U kunt er ook voor kiezen om de cellen bij ontkoppeling in een microcentrifugebuis van 1,5 ml te labelen.
Verwijder de celetiketteringsoplossing en was de cellen met PBS 1X om de overtollige kleurstof eruit te halen. Voeg het overeenkomstige ontkoppelingsmiddel toe en incubeer de cellen op 37 graden Celsius. Vergemakkelijkt het losmaken door de kolf te borstelen met een steriele celschraper en de cellen te verzamelen met een serologische pipet.
Breng de cellen over in 1,5 ml microcentrifugebuizen en centrifugeer. Gooi supernatant weg en hang de pellet opnieuw op met celkweekmedium. Kwantificeer de levensvatbaarheid van cellen met behulp van een Neubauer-kamer met trypanblauwe uitsluiting of een andere keuzemethode.
Centrifugeer en s hang de cellen in het injectiemedium opnieuw op. De aanbevolen concentraties cellen in medium zijn te vinden in tabel één van het manuscript. Vanaf dit punt moeten de cellen op ijs worden gehouden.
Injectieprocedures. Verdoof de embryo's gedurende 5 minuten in tricaine 1X. Breng vervolgens een kleine hoeveelheid verdoofde embryo's over naar een agaroseplaat en lijn ze uit met behulp van een haarspeldlus.
Zorg ervoor dat u afstand houdt tussen de embryo's. Vooral tussen de dooier van de ene en de kop van de volgende. Om sterfte te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de uitgelijnde embryo's niet uitdrogen in de agaroseplaat door voorzichtig één tot drie druppels tricaïne 1X-oplossing aan de plaat toe te voegen.
Tik lichtjes op de microcentrifugebuis om de cellen opnieuw op te schorten. Laad de injectienaald terug met een celsuspensie met behulp van een Microloader-tip, waarbij luchtbellen worden vermeden, omdat ze de integriteit van de embryo's in gevaar kunnen brengen. Open de luchtdrukklep, zet de micro-injector op en plaats de micro-injectienaald voorzichtig in de houder.
Snijd de micro-injectienaald dicht bij de punt. Doorboor voorzichtig de dooier van het embryo, laat de hoek van de naald zakken en duw voorzichtig totdat de punt van de naald de perivitelline-ruimte bereikt. Zodra de punt zich in de perivitellineruimte bevindt, injecteert u de cellen.
Probeer een volume cellen te injecteren dat vergelijkbaar is met de grootte van het oog van het embryo, en zo ver mogelijk van het hart om hartoedeem te voorkomen. Pas indien nodig de micro-injectordruk aan. Breng de geïnjecteerde embryo's over in een schone petrischaal met tricaïne 1X-oplossing en laat ze vijf tot tien minuten rusten.
Dit geeft de wond de tijd om te sluiten. Verwijder de tricaine 1X-oplossing en voeg een vers E3-medium toe. Incubeer vervolgens de embryo's op 34 graden Celsius.
Deze temperatuur zal het overleven van zowel de zebravisembryo's als de menselijke tumorcellen mogelijk maken. Gemetastaseerde test. Als u het gemetastaseerde potentieel van uw cellijnen wilt bestuderen, screent u de geïnjecteerde embryo's rond een uur na de injectie op een fluorescentiesterioscoop en sorteert u ze in twee groepen op basis van de afwezigheid of aanwezigheid van kankercellen in omloop.
Een dag na de injectie. Analyseer op een fluorescentiesteremboscoop zorgvuldig elk embryo en selecteer degenen met correct geïnjecteerde tumoren. Sorteer de geselecteerde xenograften op basis van de tumorgrootte.
Gebruik de grootte van het oog voor vergelijking. Gooi embryo's met abnormale morfologie, hart- of dooieroedeem, xenograften met zeer weinig kankercellen of embryo's met kankercellen alleen in de dooier weg. Verdeel de xenografts volgens de gewenste experimentele lay-out en start de medicijntest.
Vervang de medicijnen en het E3-medium dagelijks. Incubeer de xenograften en handhaaf de temperatuur van 34 graden Celsius tot het einde van de test. Vier dagen na de injectie.
Verdoof de xenografts op de laatste dag van de test met tricaine 1X-oplossing en lijn ze voorzichtig uit op de agarplaat. Gooi dode of gezwollen xenograften weg. Deze xenograften worden niet in aanmerking genomen voor kwantificering van engraftment.
Analyseer op een fluorescentiestereoroscoop zorgvuldig elk xenograft en beoordeel de afwezigheid of aanwezigheid van tumoren in de perivitellineruimte. Volgens de experimentele opstelling selecteert u de xenograften van belang en euthanaseert u ze met tricaine 25X. Bevestig ze in 4% formaldehyde gedurende ten minste 4 uur bij kamertemperatuur om door te gaan met immunostaining.
Bewaar anders 's nachts bij vier graden Celsius en vervang formaldehyde de volgende dag door 100% methanol. Xenografts gefixeerd in 100% methanol kunnen voor onbepaalde tijd op 20 graden worden bewaard. Hele mount immunostaining voor confocale beeldvorming.
De hele mount immunofluorescentie techniek duurt drie dagen, als volgt verdeeld. De eerste dag is voor permeabilisatie van de xenograften en primaire antilichaam incubatie. De tweede dag, voor wassen en secundaire antilichaam incubatie.
En de derde dag, voor wassen, fixeren van xenografts en opslag in het montagemedium. Meer details over deze procedure zijn te vinden in de bijbehorende PDF. Montage van xenografts.
Sluit de randen van een afdekstrip af met vaseline of siliconenvet, zodat het montagemedium niet lekt. Breng de xenografts met behulp van een Pasteur pipet over op de afdekstrip. Lijn ze voorzichtig uit met een haarspeld.
Voeg het montagemedium toe aan een andere afdekstrip. Sluit beide afdekslips voorzichtig aan en plaats ze bovenop een microscoopschuif om gemakkelijker te kunnen manipuleren. Confocale beeldvorming.
Een apochromatische 25X immersie objectieve lens met watercorrectie is optimaal voor beeldvormende tumoren met een enkele celresolutie. Verkrijg de monsters met behulp van de Z-Stack-functie met een interval van vijf micron tussen elk segment. Open de onbewerkte gegevens in Fiji-software.
Selecteer drie representatieve segmenten van de tumor van boven, midden en onder, per z-stack, per xenograft. Open de Cell Counter plugin van Fiji software. Klik in het gereedschap Celteller op Initialiseren, selecteer een tellertype en klik op de afbeelding om de telmodus handmatig te starten.
Voor elke klik vraagt de teller hoeveel cellen worden geteld. Gebruik de volgende formule om het totale aantal cellen in de tumor te verkrijgen. Om de totale aantallen of het percentage markers te beoordelen, zoals immuuncellen, mitotische figuren, geactiveerde caspase, onder andere, kwantificeer handmatig de cellen die positief zijn voor de specifieke etikettering, marker of transgene van belang langs alle segmenten van de z-stack met de Cell Counter plugin.
Houd er rekening mee dat sommige cellen zich tussen twee segmenten bevinden. Ga heen en weer in de z-stack om er zeker van te zijn dat er geen cel twee keer wordt geteld. Representatieve resultaten.
HCT 116 colorectale kankercellijn xenografts werden gegenereerd zoals beschreven in het protocol. Xenograften werden willekeurig verdeeld in niet-behandelde controles en FOLFIRI-chemotherapie. Immunofluorescentie werd uitgevoerd om apoptotische cellen te detecteren, met behulp van anti-gespleten caspase-3 antilichaam en DAPI voor nucleïne tegenstaining.
Kwantificering van de mitotische index, apoptose en tumorgrootte, onthulde dat FOLFIRI een significante afname van mitose en een significante inductie van apoptose induceert, vergezeld van een vermindering van de tumorgrootte met 54%. Deze functies zijn nuttig in fenotypische geneesmiddelenschermen met hoge doorvoer, evenals om de intrinsieke en fysiologische effecten van verschillende kankerbehandelingen in een kort tijdsbestek te testen. Een ander groot voordeel van het zebravis xenograft model is dat het mogelijk is om de interacties van verschillende tumorcellen te bestuderen en te analyseren hoe elk type cel het gedrag van de ander kan beïnvloeden.
Verschillende menselijke kankercellen, verschillende klonen van dezelfde tumor, of van verschillende tumoren, kunnen worden meege injecteerd. In dit voorbeeld werden twee colorectale kankercellijnen afgeleid van dezelfde patiënt gelabeld met verschillende lipofiele kleurstoffen en gemengd in een verhouding van één-op-één voor injectie. We hopen dat dit protocol onderzoekers kan helpen echte experts te worden in het genereren van zebravis xenografts.
Het is niet makkelijk. Je moet oefenen, oefenen. Geef niet op.
Ik weet zeker dat je er wel komt. Succes.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
