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斑马鱼拉瓦尔异种草和肿瘤行为分析的一代
Chapters
Summary June 19th, 2021
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在这里，我们提供一个分步协议，为肿瘤行为分析、全山免疫荧光和共焦成像定量提供生成异种移植物的提示和指南。
Transcript
斑马鱼异种草被广泛用于癌症研究。你可以把人类肿瘤细胞注射到小幼虫斑马鱼中，甚至注射到成人身上。在这里，我们展示的是幼虫模型的分步协议，在那里我们可以研究活体动物的几个人类癌症特征。
你可以研究增殖，你可以研究血管生成，你可以研究转移，也可以在肿瘤微环境内相互作用。一个很大的优势是，你可以在很短的时间内研究这个问题。例如，仅仅四天。
另一个很大的优点是，你可以使用共焦或光片显微镜，用单细胞分辨率来研究这个活体。你可以研究细胞如何迁移，细胞如何相互作用，甚至它们如何相互交谈。因此，这是一个非常强大的模型，研究癌症生物学。
斑马鱼异种草可用于研究对抗癌疗法的反应，如化疗、放疗，甚至有针对性的抗体疗法。最后，这个协议也可以适应使用病人衍生的细胞从手术样本，甚至从活检，然后产生斑马鱼头像。设置为注射。
注射前两周，在培养中扩大细胞。从多余的细胞和多余的鱼开始，直到精通这项技术，因为许多细胞和鱼会在训练中丢失。表一附带的PDF有一个详细的指南，其中最优比例的体外汇合注射几个细胞系。
注射前三天，穿过需要背景的斑马鱼。注射前24小时。清洁斑马鱼胚胎板。
丢弃所有死亡和未发育的胚胎，并刷新E3介质。在细胞培养室，丢弃细胞培养介质。用PBS 1X清洗一次，去除死细胞并添加新鲜介质。
为注射过程准备工具，如微注射针、糖板和发夹，以对齐胚胎进行注射。对于盘子的制备，将一层溶解的2%的香气倒入干净的培养皿的盖子中。让它聚合，并在尺子的帮助下，使三到四个直的阿加罗斯线的胚胎对齐。
注射日。将孵化的胚胎与未孵化的卵子分开。在这个阶段将质酶添加到胚胎介质中可以促进孵化。
将胚胎放入28摄氏度的孵化器中，直到注射。用于注射的细胞标记。为了帮助建立可重复的细胞标记技术，请检查表一和二的书面协议，以汇编细胞系列表和几个标签解决方案。
取出细胞培养介质，用 PBS 1X 洗两次烧瓶。用脂质染料标记细胞，避免暴露在光线下，并在 37 度孵育烧瓶。您也可以选择在分离时将细胞标记在 1.5 毫升微中微富格管中。
取出细胞标记溶液，用 PBS 1X 清洗细胞以取出多余的染料。加入相应的分离剂，在37摄氏度下孵化细胞。通过用无菌细胞刮刀刷烧瓶，用血清移液器收集细胞，促进分离过程。
将细胞转移到1.5毫升微中微管和离心机。丢弃超自然，用细胞培养介质重新悬浮颗粒。使用带有尝试盘蓝色排除或其他选择方法的 Neubauer 腔室量化细胞生存能力。
离心机并重新悬浮注射介质中的细胞。建议的中等细胞浓度可以在手稿的表一中找到。从这一点开始，细胞必须保持在冰上。
注射程序。在三角1X中麻醉胚胎5分钟。然后，将少量麻醉胚胎转移到糖板中，并在发夹环的帮助下对齐。
确保保持胚胎之间的距离。特别是在一个人的蛋黄和下一个蛋黄的头之间。为了防止死亡，通过在板中小心添加一到三滴三角星1X溶液，确保对齐的胚胎不会在糖板中干涸。
轻轻敲击微中微管，重新悬浮细胞。使用微加载器尖端用细胞悬架回装注射针，避免气泡，因为它们会损害胚胎的完整性。打开气压阀，设置微注射器，小心地将微投射针插入支架。
切开靠近尖端的微注射针。小心地刺穿胚胎的蛋黄，降低针头的角度，小心地推，直到针尖到达近视线空间。一旦尖端在近视线空间，注入细胞。
尽量从心脏注射一批与胚胎眼睛大小相似的细胞，并尽可能防止心脏水肿。如有必要，调整微注射器压力。将注射的胚胎转移到一个干净的培养皿与三卡因1X溶液，让他们休息5至10分钟。
这将给伤口时间关闭。删除三卡因 1X 解决方案并添加新鲜的 E3 介质。然后，在34摄氏度下孵育胚胎。
这种温度将允许斑马鱼胚胎和人类肿瘤细胞的生存。转移性检测。如果你想研究细胞系的转移潜力，在注射后大约一个小时，在荧光立体显微镜上筛选注射的胚胎，并根据癌细胞在循环中的缺失或存在将其分成两组。
注射后的一天。在荧光立体显微镜上，仔细分析每个胚胎，并选择那些有正确注射肿瘤的胚胎。根据肿瘤大小对选定的异种移植物进行排序。
使用眼睛的大小进行比较。丢弃任何形态异常、心脏或蛋黄水肿的胚胎、癌细胞很少的异种移植物，或仅在蛋黄内含有癌细胞的胚胎。根据所需的实验布局分配异种草，并开始药物检测。
每天更换药物和E3介质。孵化异种草，保持34摄氏度的温度，直到检测结束。注射后四天。
在检测的最后一天，用三卡因 1X 溶液麻醉异种草，并小心地将它们对齐在 agar 板上。丢弃任何死亡或肿胀的异种草。这些异种移植物不考虑用于放大定量。
在荧光立体显微镜上，仔细分析每个异种移植物，并评估肿瘤在外围空间的缺失或存在。根据实验设置，选择感兴趣的异种草，用三角25X安乐死它们。在室温下将它们固定在4%甲醛中至少4小时，以进行免疫染色。
否则，在四摄氏度的温度下过夜，第二天，用100%甲醇代替甲醛。固定在100%甲醇中的异种草可以无限期地储存在20度。用于共焦成像的全安装免疫染色。
整个安装免疫荧光技术需要三天时间，分为如下。第一天是用于异种草和原抗体孵化的渗透。第二天，用于洗涤和二次抗体孵化。
第三天，用于清洗、固定异种草和在安装介质中的存储。此程序的更多详细信息可在随附的 PDF 中找到。安装异种草。
用石油果冻或硅胶油脂密封盖片的边缘，使安装介质不会泄漏。使用巴斯德移液器，将异种草转移到盖滑上。小心地将它们与发夹对齐。
将安装介质添加到另一个盖滑。小心地将两个盖片连接起来，并将其放在显微镜滑梯上，以便于操作。对焦成像。
具有水校正的隔膜 25X 浸入式客观透镜最适合单细胞分辨率成像肿瘤。使用 Z-Stack 功能获取样品，每片之间间隔为 5 微米。打开斐济软件中的原始数据。
从顶部、中间和底部、每个 z 堆栈、每个异种移植物中选择三个具有代表性的肿瘤切片。打开斐济软件的蜂窝计数器插件。在"细胞计数器"工具中，单击"初始化"，选择计数器类型，然后单击图像以手动启动计数模式。
每次点击，计数器都会询问计算多少个单元格。要获得肿瘤中细胞的总数，请使用以下公式。要评估标记的总数或百分比，如免疫细胞、线粒体数字、活性木膏酶等，请手动量化与细胞计数器插件一起沿 z 堆的所有切片对特定标记、标记或利益的转基因呈阳性的细胞。
请注意，某些细胞将位于两片之间。在 z 堆栈中来回移动，以确保没有两次计算单元格。代表性结果。
HCT 116结肠直肠癌细胞系异种移植物如协议所述。异种移植物在非治疗对照组和福尔菲里化疗中随机分布。免疫荧光用于检测凋亡细胞，使用抗裂壳酶-3抗体和DAPI进行核反染。
线粒体指数、凋亡和肿瘤大小的量化表明，FOLFIRI 诱发线粒体病的显著减少和凋亡的显著诱导，同时肿瘤大小减少 54%。这些功能在高通量表型药物筛选中很有用，并在短时间内测试了多种癌症治疗的细胞内在和生理影响。斑马鱼异种移植模型的另一个巨大优点是，可以研究不同肿瘤细胞的相互作用，并分析每种细胞如何影响对方的行为。
不同的人类癌细胞，来自同一肿瘤或不同肿瘤的不同克隆，可以共同注射。在此示例中，来自同一患者的两个结肠直肠癌细胞系被标记为不同的脂亲染料，并混合在一对一的注射比例中。我们希望，这一协议可以帮助研究人员成为真正的专家，在产生斑马鱼异种草。
这并不容易。你需要练习，练习。不要放弃。
我相信你会到达那里的。祝你好运。
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