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ここでは、蛍光色素をマーカーとして用いた雄 のAedes aegypti の交配性を研究するためのプロトコルを提示する。雌の蚊は、交尾のためにマークされた男性と無印の両方の雄にさらされます。交配後、それらの精子は、交配パートナーを決定するために蛍光顕微鏡下で検査される。
このプロトコルは、男性の放出ベースの蚊の集団抑制プログラムの前提条件であるオスの蚊の交配競争力を測定します。このフィットネス基準は、品質管理とひずみ評価の一部として評価されます。この方法は、実験時間を90%短縮し、2つの無菌またはウォルバキア感染ライン間の交配競争力を直接比較することを可能にする。
この手順を実行すると、アイリーン・リーとケン・ワイ・マクになります。まず、そのサイズの違いに応じて、プパルの段階でオスとメスの蚊をセックスします。蚊のセットごとに、100個のオスの子犬を、スクロースの餌付けまたはローダミンBスクロースの餌付けのために、事前に標識されたケージに移します。
ケージあたり40〜50の小さなバッチにメスの子犬を入れます。イモソの出現時に、雄の蚊の存在がないかケージを確認してください。0.2%ローダミンBスクロース溶液を調製するには、10%スクロース溶液の100ミリリットルごとに200ミリグラムのローダミンB粉末を溶解する。
すべての粉末が溶解していることを確認するためによく混合します。芯付きの20個の砂糖フィーダーボトルを準備します。10本のフィーダーボトルに10%スクロースの10ミリリットル、他の10フィーダーボトルに0.2%ローダミンBスクロース溶液10ミリリットルを加えます。
準備されたすべての男性ケージに5本のフィーダーボトルを入れ、オスの蚊が交配実験の前に3日間餌を与えるようにします。水銀バーナーランプとステレオ顕微鏡をオンにします。水銀バーナーランプへの光源を10分間安定させます。
次に、赤蛍光タンパク質1に対する蛍光フィルターをセットする。口腔吸引器のガラス管に一度に少数の蚊を吸引する。ガラス管を通して、蛍光ステレオ顕微鏡下でオスの蚊の体を観察します。
実験にはローダミンBでマークされたオスの蚊のみを使用してください。移管セットオスの蚊は、網で固定された12の紙コップに入れ替えます。1杯あたり10匹のスクロースがカップごとにオスの蚊を6杯に供給し、10ローダミンBスクロースはカップ当たりオスの蚊を他の6杯に供給した。
セットBオスの蚊に対してこの手順を繰り返します。交配アッセイ用に12個のケージを設置します。6つのケージのそれぞれに、ローダミンBマークされた10セットAオスの蚊、10の無印のセットBオスの蚊、および10の処女野生型メス蚊が含まれています。
他の6つのケージには、10の無印セットAオスの蚊、10ローダミンBマークセットBオスの蚊、および10バージン野生型メス蚊が含まれます。これらのケージにラベルを付け、2つの交配の組み合わせを明確に区別します。ラベルに従って、男性のそれぞれのカップを交配ケージに入れます。
網を取り出し、カップを軽くタップして、オスをカップから出します。ケージから蚊が逃げないように、慎重に紙コップと網をケージから取り外します。オスの蚊が交配ケージに少なくとも1時間順応するようにします。
経口吸引器を使用して、12の紙コップに処女野生型のメスの蚊を移し、各カップに10匹の蚊を含む。オスの蚊の順応期間の後、すべての交配ケージにメスの1カップを移し、網を取り除きます。カップから残りのメスの蚊を励ますためにカップをそっと揺らし、ケージから慎重に紙コップと網を取り除き、蚊がケージから逃げないようにします。
交配を3時間行い、機械吸引器で各ケージからすべての蚊を取り除くことによって交配実験を終了する。氷上の蚊を少なくとも5分間冷たい麻酔をします。蚊が完全に麻酔ができたら、雌の蚊をそっと拾い、網で固定された別の紙コップに入れます。
それぞれのラベルを交配ケージからカップに移して、紙コップにラベルを付けます。女性の精子を採点するには、ステレオ顕微鏡で解剖する前に、氷上の雌の蚊を少なくとも5分間冷たい麻酔をする。立体顕微鏡でメスの蚊を解剖する。
顕微鏡で精子を調べてください。女性が授精されていない場合、3つの精子はすべて空になり、授精した場合、精子の2〜3つは運動性精子で満たされます。授精された個体の場合、RFP1フィルターを備えた蛍光ステレオ顕微鏡下で検査することにより、精子にローダミンBマーク付き精液が含まれているかどうかを判断します。
もし、ロダミンBでマークされていない精液で精子が満たされている場合、蛍光は認められない。一方、精子にローダミンBが精液と印示されている場合、それはオレンジ色の蛍光を発するであろう。この交配競争力アッセイの目的は、数世代の近親交配の後に男性の交配フィットネスに損失があるかどうかを判断することであった。
交配競技アッセイの三倍量の実験を行い、授精データをここに示す。野生型の雌は、近交系または外十交の男性のいずれかによって授精され、相互マーキングが付いた。結果は、近親交配または外交男性によって授精された女性の割合がローダミンBマーキングの影響を受けないことを示しています。
3つのレプリカントすべてで近親交配男性よりもアウトクロス男性と交配した女性の割合が有意に高く、近親交配が交配フィットネスの損失につながる可能性があることを示している。メスの蚊の余分なケージを準備することが重要です。産前のメスはすべてのデータを無効にするので、オスの蚊によって汚染されたケージからメスの蚊を使用しないでください。
実験室ベースの交配競争力アッセイ以外に、この手順は、昆虫交配生物学、集団ダイナミクス、および分散を研究するためにマーク放出再キャプチャ実験に使用することができます。
