अनाज और फलियों की नि: शुल्क घुलनशील फेनोलिक एसिड संरचना और एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक सामान्यीकृत विधि

अनाज और फलियों की मुक्त घुलनशील फेनोलिक एसिड संरचना और एंटीऑक्सिडेंट क्षमता निर्धारित करने के लिए एक सामान्यीकृत विधि। अनाज और फलियां सहित साबुत अनाज, मानव आहार का एक बड़ा हिस्सा बनाते हैं। मनुष्यों के लिए उनकी पोषण संबंधी प्रासंगिकता को लंबे समय से मान्यता दी गई है।

हालांकि, हाल ही में, उनके एंटीऑक्सिडेंट सुरक्षात्मक स्वास्थ्य लाभों की सूचना दी गई है। अनाज की बाहरी अनाज परतों और फलियों के बीज कोट में पाए जाने वाले फेनोलिक एसिड साबुत अनाज के एंटीऑक्सिडेंट गुणों में योगदान करते हैं। वे मुक्त कणों को साफ करते हैं जो बायोमोलेक्यूल्स को ऑक्सीडेटिव क्षति पहुंचाते हैं।

साबुत अनाज में पाए जाने वाले फेनोलिक एसिड के दो वर्ग हाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड और हाइड्रॉक्सीसिनमिक एसिड हैं। यह अध्ययन पूरे अनाज फेनोलिक एसिड को निकालने और उनकी इन विट्रो एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक सरल विधि प्रदान करता है। इस अध्ययन के लिए पांच साबुत अनाज के नमूनों का उपयोग करें, ड्यूरम गेहूं, पीले मकई, काली आंखों काउपी बीन, सोयाबीन और लाल गुर्दे की बीन।

सही पूरे अनाज के आटे के नमूने के 100 मिलीग्राम सीधे एक एम्बर रंग, दो मिलीलीटर क्षमता माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में वजन. ट्यूब का गहरा रंग प्रकाश के लिए मिश्रण के संपर्क को रोकने में मदद करता है। उदाहरण वाले प्रत्येक ट्यूब में 80% जलीय मेथनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें।

भंवर संक्षेप में मेथनॉल समाधान और नमूना मिश्रण करने के लिए। मुक्त घुलनशील phenolic यौगिकों को निकालने के लिए 60 मिनट के लिए नमूनों sonicate. प्रकाश से अतिरिक्त सुरक्षा के लिए sonication की अवधि के लिए नमूनों पर एक कवर रखो.

sonication के बाद, ठोस अवशेषों तलछट करने के लिए पांच मिनट के लिए 20, 000 बार जी पर मिश्रण सेंट्रीफ्यूज, शीर्ष पर supernatant छोड़ने. मुक्त फेनोलिक यौगिक centrifugation के बाद supernatant में मौजूद हो जाएगा। Supernatant HPLC उपकरण में इंजेक्ट करने से पहले फ़िल्टर किया जा करने की जरूरत है.

supernatant फ़िल्टर करने के लिए, एक 3 mL सिरिंज के प्लंजर को हटा दें और एक सिरिंज फ़िल्टर संलग्न करें। फिल्टर में एक रंध्र आकार होना चाहिए जो 0.22 माइक्रोमीटर से बड़ा नहीं होना चाहिए। पिपेट लगभग 0.4 मिलीलीटर सुपरनेटेंट के सिरिंज के शीर्ष में।

प्लंजर को फिर से डालें और फिल्टर के माध्यम से तरल को एक एचपीएलसी शीशी में धक्का दें जिसमें एक शीशी सम्मिलित हो। एक बार जब उपकरण को एचपीएलसी विश्लेषण के लिए पांडुलिपि में उल्लिखित विधि को चलाने के लिए स्थापित किया गया है, तो नमूना सूची के अनुरूप होने के लिए शीशियों को हिंडोला में लोड करें। 320 नैनोमीटर और 280 नैनोमीटर पर एचपीएलसी क्रोमैटोग्राम प्राप्त करें, जो विभिन्न फेनोलिक यौगिकों का प्रतिनिधित्व करने वाली अलग-अलग चोटियों को दर्शाता है।

उपयुक्त मानक वक्रों का उपयोग करते हुए, 320 नैनोमीटर पर हाइड्रॉक्सीसिनमिक एसिड की मात्रा निर्धारित करें क्योंकि उनके पास इस तरंग दैर्ध्य पर अधिकतम अवशोषण होता है। उसी सिद्धांत के अनुसार, हाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड को 280 नैनोमीटर पर निर्धारित करें। Trolox, विटामिन ई के एक पानी में घुलनशील एनालॉग का उपयोग करें, एक मानक के रूप में पूरे अनाज के अर्क के इन विट्रो एंटीऑक्सिडेंट क्षमता का अनुमान लगाने के लिए।

एक फाल्कन ट्यूब में ट्रॉलोक्स के एक मिलीग्राम का सही वजन करें। प्रति लीटर एक मिलीमोल का स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए 50% जलीय मेथनॉल के चार मिलीलीटर के साथ भंग करें, जो प्रति लीटर 1000 माइक्रोमोल के समान है। डीपीपीएच कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता और ट्रोलॉक्स के समकक्ष एंटीऑक्सिडेंट क्षमता, टीईएसी के अनुमान के लिए मानक वक्रों को प्लॉट करने के लिए 50, 100, 200, 400, 600, और 800 माइक्रोमोल प्रति लीटर है कि ट्रॉलोक्स की छह सांद्रता तैयार करें।

इसी तरह, ऑक्सीजन कट्टरपंथी अवशोषण क्षमता, ORAC का अनुमान लगाने के लिए 6.25, 12.5, 25, और 50 माइक्रोमोल प्रति लीटर ट्रोलॉक्स सांद्रता तैयार करें। प्रत्येक एकाग्रता की कुल मात्रा को 500 माइक्रोलीटर तक बनाएं, जैसा कि तालिका एक में दिखाया गया है। विश्लेषण से पहले मेथनॉल के साथ नमूना अर्क को पतला करें।

यहां, पीले मकई और काउपी के अर्क को दो बार पतला किया गया था। गेहूं और गुर्दे की बीन के अर्क को पांच बार पतला किया गया था, जबकि सोयाबीन के अर्क को मेथनॉल के साथ 10 बार पतला किया गया था। एक साफ, दो मिलीलीटर क्षमता, एम्बर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में ABTS के 8.23 मिलीग्राम वजन।

अगला, पोटेशियम परसल्फेट के 1.62 मिलीग्राम का वजन एक साफ, दो मिलीलीटर क्षमता, एम्बर माइक्रो सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में करें। भंवर द्वारा एक मिलीलीटर आसुत पानी में तौले गए रसायनों में से प्रत्येक को भंग करें। इसके परिणामस्वरूप 16 मिलीमोलर एबीटीएस समाधान और छह मिलीमोलर पोटेशियम परसल्फेट समाधान होता है।

ABTS और पोटेशियम persulfate समाधान बराबर मात्रा में मिश्रण द्वारा ABTS स्टॉक समाधान तैयार करें। समाधान तुरंत एक गहरे रंग में बदल जाएगा। इस मिश्रण को 12 से 16 घंटे के लिए अंधेरे में इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।

ABTS काम समाधान बनाने के लिए 200 millimolar फॉस्फेट-buffered खारा के साथ 30 बार ABTS स्टॉक समाधान पतला। ऐसा करने के लिए, ABTS काम करने वाले समाधान के दो मिलीलीटर में 200 मिलीमोलर पीबीएस के 58 मिलीलीटर जोड़ें। काम कर रहे समाधान में 0.27 मिलीमोलर एबीटीएस और 0.1 मिलीमोलर पोटेशियम परसल्फेट होगा।

विश्लेषण के लिए, एक 96 अच्छी तरह से माइक्रोप्लेट में प्रत्येक पतला निकालने के 10 माइक्रोलीटर रखें। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए एबीटीएस काम समाधान के 190 माइक्रोलीटर जोड़ें और 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एक माइक्रोप्लेट रीडर में 750 नैनोमीटर पर प्रतिक्रिया मिश्रण के अवशोषण को मापें।

एक अंशांकन वक्र प्लॉट करने के लिए प्रति लीटर 100 से 800 माइक्रोमोल तक की सांद्रता में ट्रोलॉक्स मानकों का उपयोग करें। DPPH एंटीऑक्सिडेंट परख एक कट्टरपंथी पैदा यौगिक, DPPH की आवश्यकता है. एक खाली 15 मिलीलीटर क्षमता सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में 1.2 मिलीग्राम डीपीपीएच का वजन करें।

एक 60 माइक्रोमोलर समाधान तैयार करने के लिए मेथनॉल में डीपीपीएच को भंग करें। DPPH परख नमूना अर्क की क्षमता का परीक्षण करने के लिए DPPH द्वारा उत्पादित मुक्त कणों scavenge. माइक्रोप्लेट कुओं में नमूना निकालने के पांच माइक्रोलीटर जोड़ें।

इसके बाद, 60 माइक्रोमोलर डीपीपीएच मेथनॉलिक समाधान के 195 माइक्रोलीटर जोड़ें और 60 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 515 नैनोमीटर पर absorbance को मापें। एक अंशांकन वक्र प्लॉट करने के लिए Trolox मानकों का उपयोग करें।

चित्र एक साबुत अनाज में पाए जाने वाले हाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड की संरचना को दर्शाता है। इस वर्तमान अध्ययन में, वैनिलिक एसिड एकमात्र हाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड की पहचान की गई थी। चित्र दो साबुत अनाज में पाए जाने वाले हाइड्रॉक्सीसिनमिक एसिड की संरचना को दर्शाता है।

वर्तमान अध्ययन में, नमूनों में पी-कौमेरिक, कैफिक और फेरुलिक एसिड की पहचान की गई थी। तालिका दो नमूनों में पहचाने गए फेनोलिक एसिड को दर्शाती है। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, वेनिलिक एसिड नमूनों में पहचाना जाने वाला एकमात्र हाइड्रॉक्सीबेंजोइक एसिड था।

इसकी पहचान केवल काउपी अर्क में की गई थी। हाइड्रोक्सीसिनमिक एसिड कैफेइक एसिड की पहचान केवल गुर्दे के बीन में की गई थी, जबकि पी-कौमेरिक एसिड की पहचान पीले मकई, काउपीया और सोयाबीन में की गई थी। फेरुलिक एसिड की पहचान सभी नमूनों में की गई थी और नमूनों में प्रमुख फेनोलिक एसिड था।

सबसे बड़ी से कम से कम क्रम में फेनोलिक एसिड की कुल एकाग्रता सोयाबीन, काउपीया, पीले मकई, और गुर्दे की बीन या समकक्ष के क्रम में थी, जिसके बाद गेहूं था। तालिका तीन ने नमूनों की कुल फेनोलिक सामग्री और एंटीऑक्सिडेंट क्षमता को दिखाया। एंटीऑक्सिडेंट क्षमता में DPPH कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता, TEAC, ORAC, और नमूनों की कुल एंटीऑक्सिडेंट क्षमता शामिल थी।

कुल एंटीऑक्सिडेंट क्षमता DPPH, TEAC, और ORAC मूल्यों का योग है। तालिका दो के समान, सोयाबीन में उच्चतम कुल एंटीऑक्सिडेंट क्षमता थी। हालांकि, काउपी के बजाय, यह किडनी बीन था जिसमें दूसरी उच्चतम कुल एंटीऑक्सिडेंट क्षमता थी, हालांकि काउपी में दूसरी सबसे अधिक कुल फेनोलिक एसिड सामग्री थी।

यह विसंगति व्यक्तिगत फेनोलिक एसिड की संरचनाओं और काउपी में हाइड्रॉक्सीसिनमिक एसिड के एंटीऑक्सिडेंट प्रभावों पर हाइड्रोक्सीबेंजोइक एसिड वैनिलिक एसिड के संभावित विरोधी प्रभाव से संबंधित है। इस अध्ययन ने निष्कर्ष निकाला कि साबुत अनाज उनकी फेनोलिक एसिड रचनाओं में भिन्न होते हैं। अध्ययन किए गए साबुत अनाज में, सोयाबीन में फेनोलिक एसिड की उच्चतम कुल मात्रा होती है और तदनुसार, उच्चतम एंटीऑक्सिडेंट क्षमता होती है।