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September 25, 2021
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このビデオは、膵臓系統に向かってヒト歯髄幹細胞のインビトロ誘導を示しています。幹細胞は、β細胞のビオラジを引き起こす糖尿病I型を含む多くの疾患で代替治療を行う。インスリン産生細胞の移植は、生涯を引き起こす新しい有望な方法となる。
本ビデオでは、インシュリン産生細胞を生成するための2つのアプローチについて、統合的および非統合的誘導プロトコルを含む、説明されている。そしてこの部分では、ヒト歯髄幹細胞からインスリン産生細胞を誘導するための統合プロトコルが説明される。誘導プロトコルについては、自然膵臓の発達過程を混合するためのである。
自然および機能的なインスリン産生細胞を得るために。歯髄幹細胞のような間葉幹細胞からインスリン産生細胞を生成するために、多段階誘導プロトコルが採用されている。間葉系幹細胞は、決定的な内胚葉、膵臓内胚葉、膵臓内分泌、膵臓β細胞またはインスリン産生細胞という言葉でそれぞれ使用される。
細胞を誘導するために、3段階誘導アプローチがバックボーンプロトコルとして用いられる。統合プロトコルは、ヒト歯髄幹細胞によって必須膵転写因子PDX-1の過期満了を採用した。次に、発現した幹細胞に対するPDX-1は、3段階分化プロトコルを用いてさらに誘導される。
膵分化ポテンシャルは、統合プロトコルによって、アニメーションに示されているように非統合的なプロトコルと比較される。このアイデアは、患者のインフォームド・コンセントを得て、チュラロンコン大学歯学部人間研究倫理委員会が承認したプロトコルの下で行われました。このプロトコルは、PDX-1 の有効期限を超えて開始されました。
ヒトの歯髄幹細胞は、2~5の一部で、70~80%の合流を有し、この導入に使用されます。細胞はトリプシン化され、カウントされます。その後、100万個の細胞がトランスフェクション容器に座り、一晩インキュベートされます。
24時間後、PDX-1遺伝子を運ぶ新たに調製されたウイルス対策が、所望の感染の多重度に応じて培養容器に添加される。その後、トランスフェクトされた細胞をインキュベーターに24時間保管する。次いで、新鮮な培養培地を変え、さらに48期間維持する。
トランスフェクトされた細胞の形態は、さらなる誘導ステップに使用する前にチェックされます。PDX-1を持つヒト歯髄幹細胞は、その後、トリプチマイト化され、第1の膵インダクション培地に懸濁され、この工程 A.In の培地と呼ばれ、低い付着培養容器が用いられる。PDX-1の形態は、中A誘導後3日目に発現したヒト歯髄幹細胞に対する形態が観察された。
良好な形態を有する細胞は、さらなる誘導ステップに使用されます。次の工程では、第2の誘導媒体を、いわゆる培地Bが培養容器に添加される。PDX-1の形態は、培地誘導後2日目に発現したヒト歯髄幹細胞に対する形態が観察された。
良好な形態を有する細胞は、さらなる誘導ステップに使用されます。次の工程では、第3の誘導媒体、いわゆる培地Cが培養容器に添加される。5日後に細胞の形態が観察される。
細胞コロニーは、さらなる分析のために収集されます。コロニーの形態と大きさ、膵臓遺伝子マーカー発現およびグルコース刺激Cペプチド分泌またはGSCSアッセイに関する機能的特性を含む。非統合誘導アプローチでは、前述の3段階誘導プロトコルが採用されています。
100万個の細胞が培地Aに再び懸濁され、低い付着培養容器に座っている。その後、3日間培養します。形態がチェックされた後、培地BおよびCを含む一連の誘導培地は、その後、3日目と5日目に培養容器にそれぞれ添加される。
10日目には、細胞形態が観察される。細胞コロニーは、コロニーの形態や大きさ、膵臓遺伝子マーカー発現、グルコース刺激Cペプチド分泌またはGSCSアッセイに関する機能性を含むさらなる分析のために収集されます。両方の誘導プロトコルの結果は、両方のプロトコルで比較されます。
ヒトの歯髄幹細胞は、誘導の最初の日からコロニーのような構造を形成することができる。コロニーの外観は丸く、密です。すべてのコロニーは、誘導期間を通じて培養容器に浮かんでいる。
統合誘導プロトコルのコロニー総カウントは、非統合誘導のコロニー数より少し高い。コロニーサイズの割合の下での進化は、コロニー内の壊死コアを減少させることが重要である統合誘導時の中小コロニー形成から有益な傾向を示す。膵臓遺伝子マーカー解析は、統合誘導性プロトコルが、MAP-A、GLUT-2、インスリン、およびGLP-1Rを含む膵マーカーの高い有効期限を有するコロニーを生じさせることを明らかにし、測定されたインスリン産生細胞に対する分化を示唆した。
その機能にはCペプチド分泌が重要である。結果は、両方の誘導プロトコルがグルコースチャレンジに対する良好な応答を有するコロニーをもたらすことを示している。本研究から、膵期の両方の誘導プロトコルは、膵マーカーの満了および機能的性質の点でインビトロでインスリン産生細胞を生成することができ、プロトコルは、インスリン産生細胞形成のより良い品質を示す。
近い将来、幹細胞系糖尿病治療におけるヒト歯髄幹細胞の適用のようなヒト間葉系幹細胞の動向を示唆する。
Summary
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このプロトコルは、ヒト歯髄幹細胞(hDpSC)を インビトロの膵臓系統に対して分化するための2つの異なる誘導プロトコル(統合プロトコルと非統合プロトコル)の比較を示す。統合プロトコルは、より多くのインスリン産生細胞(IPC)を生成する。
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Kuncorojakti, S., Rodprasert, W., Le, Q. D., Osathanon, T., Pavasant, P., Sawangmake, C. In vitro Induction of Human Dental Pulp Stem Cells Toward Pancreatic Lineages. J. Vis. Exp. (175), e62497, doi:10.3791/62497 (2021).
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