This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Proteomic Profil af EPS-Urin gennem FASP Fordøjelse og data-uafhængig analyse
Chapters
Summary May 8th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Her præsenterer vi en optimeret in-filter fordøjelsesprotokol med detaljerede oplysninger om følgende: protein fordøjelse, peptidrensning og data uafhængig erhvervelse analyse. Denne strategi anvendes til analyse af udtrykte prostatiske sekreter-urinprøver og giver mulighed for høj proteom dækning og lav manglende værdi etiket-fri profilering af urin proteome.
Transcript
FASP-protokollen er en interessant tilgang til dine urin proteomics på grund af dens kompatibilitet med stærkt denatureringsbuffere og på grund af dens evne til at koncentrere prøven på filteret, hvilket er kritisk for en fortyndet proteinprøver. FASP-protokollen kombineret med data uafhængig analyse massespektrometri giver os mulighed for at opnå dyb proteom dækning i EPS-urin, som er urin indsamlet efter digital rektal eksamen. Vi anvender i øjeblikket den metode, du er ved at se i en biomarkør opdagelse indsats på prostatakræft.
Proceduren vil blive vist af Licia Prestagiacomo, Paola Morelli og Caterina Gabriele. Centrifuge EPS-urinprøver inden for to timer efter indsamling i 10 minutter ved 2.100 RCF ved stuetemperatur. Opbevar derefter supernatanterne ved minus 80 grader celsius, indtil de bruges.
Smid prøverne på is, eller ved fire grader. For at fremskynde proceduren kan du overføre prøverne fra minus 80 til minus 20 dagen før fordøjelsen. Som lagerløsninger skal du bruge 500 millimolar DTT, 10%SDS, en molar Tris buffer ved pH otte.
Fortynd 500 mikroliter af hver EPS-urinprøve med 67 mikroliter SDS, 67 mikroliter DTT og 33 mikroliter Tris buffer. Inkuber ved 95 grader celsius i 10 minutter med blid rysten. Saml centrifugalfilterenheden med en 10.000 Dalton molekylær vægt afskåret.
Derefter tilsættes 300 mikroliter fortyndet EPS-urinprøve til filteret. Centrifuge ved 14.000 g i ca. 20 minutter. Du kan midlertidigt afbryde proceduren efter ca. 15 minutter for at kontrollere, om filtreringen forløber problemfrit.
Fortsæt, indtil hele opløsningen har passeret gennem filteret. Derefter tilsættes 200 mikroliter urinstofbuffer og centrifuge ved 14.000 g i 15 minutter. Gentag dette trin igen.
Når gennemstrømningen er ved at berøre filteret, skal du tømme kollektionen Eppendorf ved at pipette flow-through ud. Proteiner er sikre på filteret. Til cysteinalkylering fremstilles en iodoacetamidopløsning umiddelbart før brug.
Der afvejes ca. 10 mg iodoacetamid i et antal Eppendorf-hætteglas, og det opløses i urinstofbuffer i en koncentration på 9,25 mg pr. ml eller i molaritetsmæssig henseende 50 millimolar. Der tilsættes 50 mikroliter iodoacetamidopløsning til hvert filter og centrifuge ved 6.000 g i 25 minutter. Den lavere centrifugeringshastighed gør det muligt for filtrene ikke at løbe tør.
Efter proteinalmylering vaskes filtrene med to på hinanden følgende 200 mikroliter aliquots af urinstofbuffer og centrifuge ved 14.000 g i 20 minutter. Kassér gennemstrømningen. Der tilsættes 200 mikroliter på 50 millimolar tre ethylammoniumbicarbonatbuffer og centrifuge ved 14.000 g i 20 minutter.
Gentag dette trin. Når den sidste bicarbonatvask er færdig, skal filterenheden overføres til et nyt opsamlingsrør. Derefter tilsættes 60 mikroliter af 50 millimolar TEAB buffer.
Der tilsættes en mikroliter trypsinopløsning i en koncentration på 200 nanogram pr. mikroliter trypsin. Alternativt kan du forberede fordøjelsesbufferen til alle prøver i et Eppendorf-hætteglas og distribuere 61 mikroliter af fordøjelsesbufferen til hvert filter. Hvis du bruger en ThermoMixer for at undgå prøvefordampning under inkubation natten over, skal du pakke hver filterenhed med et lag aluminiumsfolie og derefter et lag parafilm.
Inkuber prøverne ved 37 grader natten over. Den følgende morgen overføres filtrene til en bænktopcentrifuge for et meget kort spin. Efter spinding skal du åbne Eppendorf-lågene og tilføje 140 mikroliter vand.
Centrifuge hætteglassene ved 14.000 g i 25 minutter for at opsamle peptider. Det indsamlede volumen skal være omkring 190 mikroliter. For at fjerne spor af SDS fra fordøjet anbefales stærk kationbytningsrensning af peptider før LC-MS-MS.
Forbered mikrokolumneholderne ved at gennembore Eppendorf-lågene med et skarpt værktøj som en pincet eller saks. Holderen vil rumme mikrokolonnen under centrifugering. Da de er kedelige at forberede, kan indehavere bruges flere gange.
Ved hjælp af en stump og en nål skal du fjerne en mindeplade på den relevante ekstraktionsskive. Ekstraktionsskiver er bløde polymere materialer, der indeholder sorbentpartikler. I dette tilfælde er sorbent lavet af partikler med stærke kationbytteregenskaber.
Indkvarter pladen i en 200 mikroliter pipette spids. Brug et stempel til at skubbe stikket mod enden af spidsen. Den lille skive skal skubbes fast, men undgå overdreven styrke.
Sæt spidsen i holderen og saml spinmikrobiinen ved hjælp af et hætteglas med to milliliter Eppendorf, hvorfra det oprindelige låg blev fjernet. Stikket fra en måler 16 nål vil have en lasteevne på omkring fem mikrogram peptider. Konditioner mikrokolonnen med to på hinanden følgende vaske.
Den korrekte hastighed afhænger af, hvor stærkt du skubber disken ind i pipettespidsen. Sigt efter at opnå en flowrate i størrelsesordenen 20 til 30 mikroliter i minuttet. Lad være med at få spidsen til at løbe tør under vask og under prøvebelastning.
Prøven fortyndes fem gange i vaskeopløsning to, og resultaterne indlæses i opløsningen ved langsommere hastighed. Sigt efter en flowrate på ca. 15 til 20 mikroliter i minuttet. Hvis det er nødvendigt, skal du kassere flow-through.
Vask restvaskemidler væk. Lad derefter skiven løbe tør før peptide eluering. Overfør mikroklumnen til et rent 1,5 Eppendorf-rør, og tilsæt straks elueringsrøret.
Som vil være syv mikroliter af en 500 millimolar ammoniumacetatopløsning indeholdende 20%acetonitrile. Eluatet fortyndes med 27 mikroliter på 0,1 % myresyre for at sænke procentdelen af organisk opløsningsmiddel og derefter injicere to mikroliter af den resulterende opløsning i LC-MS-MS med påvisning i dataafhængig tilstand. Oplysninger om den LC-MS-opsætning, der bruges i denne protokol, vil blive givet senere i videoen.
Når du har udført databasesøgning og peptidfejlintegration, skal du beregne det overordnede topområde. Sammenlign det derefter med en ekstern standardkurve for at estimere peptidkoncentrationen i FASP-digesten. Efter at have estimeret peptidmængden skal du rense en ny aliquot af FASP-fordøje svarende til to mikrogram peptider med to på hinanden følgende StageTip-rensninger som beskrevet her.
Den LC-MS-opsætning, der bruges i denne protokol, er baseret på direkte injektion i analysekolonnen. Hvis du bruger et system med en diffuseringskolonne, kan du undgå trinnet i offline C18-rensning. Husk at bruge dedikerede nåle og stempler til hvert kromatografisk materiale.
Efter eluting peptider fra C18 Stage Tip med 10 mikroliter eluent, delvist fordampe eluat i et vakuum centrifuge i et par minutter, forsøger at undgå fuld fordampning. Derefter tilsættes 47 mikroliter på 0,1% myresyre og placeres den resulterende opløsning i et HPLC-hætteglas til LC-MS-analyse. Det system, der bruges her, er baseret på direkte belastning af kolonneeksempler uden brug af en diffuseringskolonne.
Analytiske kolonner er in-house lavet ved at trække en 75 mikrometer ID kapillær efter fjernelse af et stykke polyamid belægning. Den resulterende spids kan formes forsigtigt med en keramisk fræser. Kapillæren anbringes derefter i en pakkebombe og pakkes med en 50 mg/ml isopropanol gylle af C18 tre mikrometer stationære fasepartikler.
Der er behov for et gastryk på mellem 10 og 20 stænger kvælstof eller helium. Du kan bruge alternative eller kommercielle kromatografisøjler, der kører ved submikrobielle kolonner pr. minutstrøm. Saml kolonnen på et T-stykke.
De to andre ender er forbundet til højspændingsforsyningen og hplc-sløjfen. Vurder den optimale sprøjtespænding ved at køre systemet ved isokratisk flow. Start derefter din analyse.
Adskil peptider over en to timer lang kromatografi gradient som vist. Dataindsamlingen vil bestå af en hurtig fuld MS-tjenestescanning efterfulgt af 26 MS-MS-scanninger på prækursorvinduer med variabel bredde. Starter i 20 m / z bredde, for de første 20 vinduer, som vil dække en m / z interval fra 350 til 750 Thompson.
Derefter flyttes til en 50 m / z bredde for de følgende fem vinduer og slutter med en enkelt MS-MS scanning, der har en isolation bredde på 200 Thompson. Snævrere bredder tegner sig for en mere befolket region af spektret med hensyn til tilstedeværelsen af peptidprækursorer. Til DIA-analyse skal du bruge et spektralbibliotek.
For at generere et spektralbibliotek kan du udføre nogle få dataafhængige eksperimenter på det samme LC-MS-MS-system, som du har brugt til anskaffelse af data ved hjælp af samme kromatografigradient. Prøvefraktionering vil øge proteomedækningen. Stage Tips kan bruges til prøve fraktionering.
Stærk kation udveksling og grundlæggende omvendt fase er to gyldige alternativer. Start med de 10 mikrogram af en pulje af flere FASP fordøjer. Prøven forsures med en endelig koncentration på 0,2 %.
Lad peptider på høj kapacitet C18 Stage Tips. Brug flere diske i tilfælde af høje peptidmængder. For 10 mikrogram materiale anbefales to skiver.
Udfør C18-rensning som beskrevet tidligere. Forbered flere hætteglas til eluatsamling. Så mange som antallet af brøker.
I dette tilfælde produceres 10 fraktioner ved trinvis udtrækning. Efter den sidste vask tilsættes 20 mikroliter af den første eluering. 0,2%ammoniumhydroxid, 10 millimolar TEAB, 4%acetonitrile.
Efter fuldt ud at have udtring den første brøkdel i den første Eppendorf, skal du flytte Stage Tip til næste kollektionsglas. Fortyndes i 20 mikroliter trin ved hjælp af som eluent, 0,2% af ammoniumhydroxid, 10 millimolar TEAB, og derefter stigende mængde acetonontril. Når du har fraktioneret eksemplet og kørt dataafhængige eksperimenter på hver brøk, skal du generere spektralbiblioteket ved hjælp af databasesøgning af MS-MS-data.
Biblioteket vil derefter blive importeret i en software, der er i stand til DIA dataanalyse for protein kvantificering baseret på mindst én unik peptid tildelt af mindst tre overgange. Forvent at dække en bred vifte af urin proteome. Dette tal viser identifikation og kvantificering af proteiner på tværs af en overflod rækkevidde, der spænder over fem størrelsesordener.
Arbejdsgangen her præsenteret kombinerer koncentrationsfordelen og alsidigheden af FASP-protokollen med følsomheden af DIA-scanningstilstand. Denne kombination giver et rigt kort over urin proteome. Da vores analyseopsætning ikke omfatter brugen af en diffuseringskolonne, blev FASP-digesten renset af både stærk kationbytning og omvendte fasetrintips.
Trinnet Forvendte fasetip for fase kan udelades, når en diffuseringskolonne er forbundet direkte til analysekolonnen. Brugen af denne arbejdsgang anbefales til analyse af EPS-urinprøver, men dets brug kan udvides til urin proteomics generelt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
