A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Disseksjon av enkle skjelettmuskulaturfibre for immunfluorescerende og morfometriske analyser av hel-mount nevromuskulære veikryss
Chapters
Summary August 14th, 2021
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Evnen til å nøyaktig oppdage nevromuskulære koblingskomponenter er avgjørende for å evaluere modifikasjoner i arkitekturen på grunn av patologiske eller utviklingsmessige prosesser. Her presenterer vi en komplett beskrivelse av en enkel metode for å oppnå bilder av høy kvalitet av helmonterte nevromuskulære veikryss som kan brukes til å utføre kvantitative målinger.
Transcript
Disseksjon av enkle skjelettmuskulaturfibre for immunfluoreserende og morfometriske analyser av helmonterte nevromuskulære veikryss. Denne videoen vil demonstrere en protokoll for effektivt og sikkert dissekere EDL og soleus muskler med en repeterbar tilnærming. Denne videoen vil også lære å oppnå helmonterte nevromuskulære veikryss med sikte på å gjenkjenne synaptiske komponenter med 3D-integritet for å tillate en nøyaktig morfometrisk analyse.
For å dissekere musklene, er disse kirurgiske instrumentene nødvendige. For å starte prosedyren, plasser dyret med magen vendt oppover. Lag et innledende snitt ved hjelp av et kirurgisk blad mellom tærne mot bakre lemmer.
Skrell av huden, trekk oppover til høyre kne er utsatt. For å finne EDL, følg fot sener til ringformet ligament. Dette ligamentet sirkler rundt to sener.
Klipp ligamentet med Uniband-saksen mellom de to senene. Identifiser EDL-senen ved å løfte begge og se hvilken som får tåene til å bevege seg oppover. Klipp senen med saks.
Mens du holder senen med biologiske pinsett, begynner du sakte å skille EDL-muskelen fra de andre bakre lemmusklene. Separasjon av muskelen uten å forårsake skade kan gjøres ved å gjøre ulike kutt på resten av laterale muskler for å åpne en bane mellom dem, mens du holder og løfter muskelen fra splitting delen av EDL senen. For å isolere muskelen helt, kutt senen som er festet til rotte kneet ved hjelp av Uniband saks.
Senk den dissekerte muskelen i den fixative løsningen, og la den stå i 24 timer ved fire grader Celsius. Generelt er det nyttig å ha en langstrakt muskel. For å gjøre dette, bruk papp og stifter for å feste muskelen for fiksering.
For å isolere soleusmuskelen, snu dyret. Gjennom huden, kutt calcaneal senen ved hjelp av et kirurgisk blad. Ved hjelp av de biologiske pinsettene og Uniband saks, skille gastrocnemius muskelen fra beinene, skape et muskuløst lokk.
Sålen vil være på innsiden av muskellokket. Det kan identifiseres fordi det er rødt og flatt. Med et par biologiske pinsett, nå og løft soleus senen som ligger over over gastrocnemius.
Klipp senen med Uniband saks. Løft hele muskelen mens du kutter noen av de svake festepunktene. Til slutt, for å frigjøre soleusmuskelen helt, kutt sålen vesicle som danner calcaneal senen.
Gjenta fikseringstrinnet som gjort med EDL-muskelen. For å bruke denne metoden er det viktig å sikre stiftene til senene og ikke til muskelen. Når den 24-timers fikseringsperioden har gått, skyll musklene i DPBS-løsningen før du begynner å isolere muskelfibrene.
For å isolere fibrene, hold forsiktig en av senene med ett par biologiske pinsett. Deretter med det andre paret biologiske pinsett, begynner å sakte klemme senen for å skille muskelfibrene. For å isolere fibrene, trekk sakte oppover mot motsatt muskelsenne.
Det vil være nødvendig å gjenta denne handlingen flere ganger til du får flere, små, isolerte bunter. Når de er separert i små isolerte bunter, plasser dem forsiktig i en forhåndsbehandlet silanisert lysbilde. Det er nødvendig å holde alle fibrene ryddig slik at de ikke overlapper.
På dette tidspunktet kan fibrene bli igjen for å lufttørke i 24 timer. Etter 24 timer, begynn immunstaining. For å lage en vanntett barriere, bruk en PAP-penn for å omringe de isolerte muskelfibrene i det forhåndsbehandlede lysbildet.
Dette er et eksempel på et konfokalt bilde med høy oppløsning som kan hentes ved å følge protokollen som er beskrevet her. Øverst til venstre vises det postsynaptiske elementet, og øverst til høyre vises det presynaptiske elementet, mens de nederste bildene viser de synaptiske komponentene skjematisert for å illustrere parametrene som skal brukes til morfometrisk analyse. Det andre lysbildet viser sammenslåingen av pre- og postsynaptiske signaler med kjernen i API-et.
Forskjeller mellom nevromuskulære kryss av transgene dyr og ikke-transgene dyr er tydelig synlige. Den morfometriske analysen av nevromuskulære veikryss viser bevis på det postsynaptiske signalet hos transgene dyr og ser ut til å være mer kompakt, hovedsakelig på grunn av redusert nevromuskulært kryss totalareal. Som vist her, reduseres det nevromuskulære krysset presynaptisk område av det transgene dyret.
Den minste som ble oppdaget var den som ble funnet med anti-fosforylatert nevrofilamentsignal, som vist i bilde B, for eksempel. Det siste bildet viser resultatene knyttet til statusen til helmonterte nevromuskulære veikryss. Ved hjelp av dekningsindeksen ble det fastslått at de transgene nevromuskulære kryssene ble funnet delvis denervated.
Det kan også bestemme at dekningen og nexus av fosforylatert nevrofilament er lavere enn oppnådd når en ikke-fosforilert nevrofilament oppdages. Den foreslåtte protokollen gjør det mulig å oppnå nevromuskulære knutepunktpreparater av høy kvalitet fra langsomme og raske muskelfibre. Pre- og postsynaptiske nevromuskulære koblingskomponenter ble identifisert av spesifikke sonder eller antistoffer, og deretter avbildet i konfokal eller superoppløselig konfokal mikroskopi, noe som muliggjør morfometrisk analyse i mikrometrisk skala.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
